王盛堯 陳 宇 譚順林
(四川省資陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,資陽(yáng)市 641300,電子郵箱:wqp296@163.com)
慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心肌梗死、心肌肥厚、心肌纖維化等心臟病變發(fā)展的終末階段,其致殘率、致死率均較高,且花費(fèi)高、預(yù)后差,是目前全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-2]。心室重構(gòu)是CHF發(fā)生和發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。心室出現(xiàn)心肌損傷或負(fù)荷增加,可引起基因調(diào)控的分子、細(xì)胞和心肌間質(zhì)發(fā)生變化,導(dǎo)致心肌收縮功能障礙和心室肥厚失代償,進(jìn)而引起心室重構(gòu),是影響CHF發(fā)病率和病死率的重要因素[3]。因此,尋找有效生物學(xué)指標(biāo)早期評(píng)估及診斷CHF,并采取針對(duì)性措施進(jìn)行干預(yù),對(duì)改善患者病情、提高預(yù)后有重要意義。
微小RNA(microRNA,miRNA)具有作為心血管疾病生物標(biāo)志物的潛在作用。Liu等[4]發(fā)現(xiàn),急性心肌梗死模型大鼠血清中的miRNA-29b水平低于正常大鼠,miRNA-29b可能通過(guò)激活Notch信號(hào)通路抑制心肌纖維化和心肌肥大。血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是一類(lèi)結(jié)締組織細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的促有絲分裂原和化學(xué)催化劑,可以刺激細(xì)胞分裂、增殖,參與多種血管性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。研究表明,急性心肌梗死患者血清PDGF水平較健康人升高[6]?;趍iRNA-29b和PDGF在心肌疾病中均呈異常表達(dá),本文分析CHF患者血清中miRNA-29b和PDGF的表達(dá)情況,探討二者與病情嚴(yán)重程度、心室重構(gòu)的相關(guān)性,以期為相關(guān)的臨床研究及指標(biāo)檢測(cè)提供參考。
1.1 臨床資料 納入2017年3月至2019年3月在本院心內(nèi)科住院治療的148例CHF患者作為CHF組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)制定的《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》[7]中CHF的診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)臨床資料完整;(3)自愿參與研究且中途無(wú)退出者;(4)患者家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)近1個(gè)月內(nèi)行血管重建術(shù)者;(2)近3個(gè)月內(nèi)有急性心肌梗死、嚴(yán)重肝腎功能不全者;(3)近3個(gè)月內(nèi)有不穩(wěn)定型心絞痛者;(4)嚴(yán)重感染者及自身免疫性疾病患者;(5)惡性腫瘤患者;(6)近3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)可能影響PDGF等檢測(cè)指標(biāo)的藥物或制劑者。148例CHF患者中男性82例、女性66例,年齡40~74(57.18±8.22)歲;根據(jù)美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì)(New York Heart Association,NYHA)心功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)CHF患者進(jìn)行分級(jí),其中Ⅰ~Ⅱ 級(jí)47例(Ⅰ~Ⅱ級(jí)亞組)、Ⅲ級(jí)52例(Ⅲ級(jí)亞組)、Ⅳ級(jí)49例(Ⅳ級(jí)亞組);發(fā)生心室重構(gòu)44例(心室重構(gòu)亞組),未發(fā)生心室重構(gòu)104例(非心室重構(gòu)亞組)病程1~9(4.98±1.60)年;原發(fā)疾?。汗谛牟?4例,高血壓心臟病57例,心臟瓣膜病27例。另選取同期在本院體檢的150例健康者作為對(duì)照組,心臟功能均正常,無(wú)吸煙、飲酒史。其中男性81例、女性69例,年齡43~70(56.36±6.51)歲。本研究符合《赫爾辛基宣言》,經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施,所有患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。
1.2 臨床資料收集 收集研究對(duì)象的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)疾病情況等一般資料。
1.3 血清指標(biāo)的檢測(cè)
1.3.1 主要試劑與儀器:TRIzol試劑(貨號(hào):MN562J2)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):J6547M)、熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào):N5643MJ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;miRNA-29b及內(nèi)參U6引物由上海生工生物工程有限公司合成;PDGF酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):SEA480Hu-1)購(gòu)自上海嵐派生物科技有限公司。熒光定量PCR分析儀(型號(hào):YFGB1022)購(gòu)自日本Olympus公司。
1.3.2 血清樣本的采集與保存:抽取所有研究對(duì)象(CHF組于入院次日清晨、對(duì)照組于健康體檢時(shí))的空腹肘靜脈血5 mL,注入無(wú)菌離心管中混勻,室溫條件下以4 000 r/min離心10 min,取上清液,于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清PDGF水平:從-80℃冰箱中取出凍存血清,解凍后采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定受試者血清中的PDGF水平。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定血清miRNA-29b表達(dá)水平:從-80℃冰箱中取出血清樣本,按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),所用引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為20 μL,包括SYBR Premix I Ex TaqTM10 μL、cDNA 1 μL、H2O 8 μL、上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)處理20 s,95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 10 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miRNA-29b的相對(duì)表達(dá)水平。
表1 引物序列
1.3.5 基于生物信息學(xué)分析miRNA-29b與PDGF關(guān)系:基于生物信息學(xué)網(wǎng)站miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)預(yù)測(cè)miRNA-29b和PDGF的結(jié)合位點(diǎn)。
1.4 超聲心動(dòng)圖檢查 由本院超聲科專職醫(yī)師使用美國(guó)HP5500型彩色多普勒超聲心動(dòng)儀診斷系統(tǒng),對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行心臟彩色超聲檢查,測(cè)定左心功能。囑患者左側(cè)臥位,取胸骨旁左心室長(zhǎng)軸切面,測(cè)定并記錄左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左心室舒張末期室間隔厚度、左心室后壁厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑。根據(jù)Devereux等[9]提出的公式計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI),LVMI=左心室重量/體表面積,其中左心室重量=1.04×[(左心室舒張末期室間隔厚度+左心室后壁厚度+左心室舒張末期內(nèi)徑)3-左心室舒張末期內(nèi)徑3]-13.6,體表面積=0.006×身長(zhǎng)(cm)+0.013×體重(kg)-0.153。所有參數(shù)均測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期,取平均值。計(jì)算LVEDV增長(zhǎng)率,即△LVEDV%=(LVEDV1-LVEDV0)/LVEDV0×100%,其中LVEDV0為CHF患者發(fā)病后4 d的LVEDV,LVEDV1為隨訪6個(gè)月時(shí)的LVEDV;將△LVEDV%≥20%定義為心室重構(gòu)[10]。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示,方差齊時(shí)兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);方差不齊時(shí),兩組間比較采用Mann-Whitneyu檢驗(yàn),多組間比較則采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 4組一般資料的比較 4組的性別、年齡、合并糖尿病情況、合并高血壓情況、體質(zhì)指數(shù)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。
表1 4組一般資料的比較
2.2 不同心功能亞組CHF患者血清miRNA-29b和PDGF水平的比較 與對(duì)照組比較,各心功能亞組CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平均降低,血清PDGF水平均增高(P<0.05);Ⅰ~Ⅱ級(jí)亞組、Ⅲ級(jí)亞組、Ⅳ級(jí)亞組CHF患者的血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平依次降低,血清PDGF水平依次升高(均P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 不同心功能亞組CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平和PDGF水平與對(duì)照組的比較(x±s)
2.3 心室重構(gòu)亞組和非心室重構(gòu)亞組CFH患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平和PDGF水平的比較 與非心室重構(gòu)亞組比較,心室重構(gòu)亞組CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平降低,血清PDGF水平升高(均P<0.05)。見(jiàn)表3。
表3 心室重構(gòu)亞組與非心室重構(gòu)亞組CFH患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平和PDGF水平的比較(x±s)
2.4 4組超聲心動(dòng)圖左心室重構(gòu)指標(biāo)的比較 與對(duì)照組比較,各亞組CHF患者的LVMI、LVEDV水平均升高,LVEF水平均降低(均P<0.05);Ⅰ~Ⅱ級(jí)亞組、Ⅲ級(jí)亞組、Ⅳ級(jí)亞組CHF患者的LVMI、LVEDV水平依次升高,LVEF水平依次降低(均P<0.05);Ⅲ級(jí)亞組、Ⅳ級(jí)亞組CHF患者的心室重構(gòu)率高于Ⅰ~Ⅱ級(jí)組患者(均P<0.05)。見(jiàn)表4。
表4 不同心功能亞組CHF患者超聲心動(dòng)圖心室重構(gòu)指標(biāo)與對(duì)照組的比較
2.5 CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平和PDGF水平的相關(guān)性 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,miRNA-29b和PDGF存在結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖1。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平與血清PDGF水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.601,P<0.001)。
圖1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果
2.6 CFH患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平和PDGF水平與左心室重構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)性 在CHF患者中,血清miRNA-29b表達(dá)水平與LVMI、LVEDV呈負(fù)相關(guān)(r=-0.538,P<0.001;r=-0.512,P<0.001),與LVEF呈正相關(guān)(r=0.496,P<0.001);血清PDGF水平與LVMI、LVEDV呈正相關(guān)(r=0.520,P<0.001;r=0.529,P<0.001),與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.467,P<0.001)。
CHF是由于心臟收縮功能及舒張功能發(fā)生障礙,不能將靜脈回心血充分排出心臟,導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積、動(dòng)脈血液灌注不足而引起心肌結(jié)構(gòu)異常和心功能不全的一種臨床綜合征,其是心血管疾病發(fā)展的終末階段[11]。左心室重構(gòu)是心血管事件中重要的靶器官損害及并發(fā)癥,是心臟對(duì)慢性容量和壓力超負(fù)荷的適應(yīng)性改變,可使心肌細(xì)胞肥大、纖維化,心肌代謝及電生理發(fā)生改變,導(dǎo)致左心室容積增大,最終導(dǎo)致CHF[12]。因此,探尋有效生物學(xué)指標(biāo)用于評(píng)估左心室重構(gòu)從而及時(shí)采取相應(yīng)措施進(jìn)行干預(yù),對(duì)預(yù)防及治療CHF有重要意義。
miRNA為單鏈RNA分子,參與調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程[13]。越來(lái)越多研究表明miRNA在心血管疾病中發(fā)揮作用[14]。如劉志立等[15]研究報(bào)道,血清miRNA-29b表達(dá)水平降低與急性心肌梗死的發(fā)生有關(guān),且可作為預(yù)測(cè)患者死亡的指標(biāo)之一;Zhu等[16]發(fā)現(xiàn),小檗堿可以通過(guò)誘導(dǎo)miRNA-29b表達(dá)上調(diào)來(lái)促進(jìn)血管生成,進(jìn)一步縮小小鼠心肌梗死面積,從而改善心臟功能;Wang等[17]發(fā)現(xiàn),腎交感神經(jīng)去神經(jīng)支配可能通過(guò)上調(diào)miRNA-29b的表達(dá)來(lái)減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的左心室重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示,各亞組CHF患者的血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組,且隨著心功能分級(jí)的增加而逐漸降低(均P<0.05)。這提示miRNA-29b異常低表達(dá)可能不僅與CHF的發(fā)生有關(guān),同時(shí)也與病情嚴(yán)重程度關(guān)系密切。
PDGF是成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及其他間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞的強(qiáng)有絲分裂原和化學(xué)驅(qū)動(dòng)劑,也是心血管系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子[18]。任良強(qiáng)等[19]發(fā)現(xiàn),不穩(wěn)定型心絞痛患者治療后PDGF水平顯著低于治療前,且隨著NYHA心功能分級(jí)下降而逐漸降低。初志輝等[20]研究報(bào)道,穩(wěn)定型心絞痛患者血清PDGF水平明顯高于健康人群,且血清PDGF水平與患者冠狀動(dòng)脈病變程度有一定關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示,各亞組CHF患者血清PDGF水平高于對(duì)照組,且隨著心功能分級(jí)的增加而逐漸升高(均P<0.05),與上述研究結(jié)果相似。這提示PDGF水平異常高表達(dá)與CHF發(fā)生有關(guān),同時(shí)也與病情嚴(yán)重程度關(guān)系密切。我們進(jìn)一步行生物信息學(xué)預(yù)測(cè),結(jié)果提示miRNA-29b與PDGF的3′端非編碼區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn),且相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平與PDGF水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),提示miRNA-29b可能通過(guò)負(fù)調(diào)控PDGF影響CHF的發(fā)生和發(fā)展。
LVMI、LVEF、LVEDV是評(píng)價(jià)心室重構(gòu)的敏感性指標(biāo),其中LVMI通過(guò)患者的左心室質(zhì)量及體表面積評(píng)估心臟生理情況[21]。Huang等[22]發(fā)現(xiàn),與健康人群比較,原發(fā)性高血壓患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平與LVMI呈正相關(guān),提示miRNA-29b或可反映原發(fā)性高血壓患者的靶器官損害情況。本研究中,對(duì)照組、Ⅰ~Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組的LVMI和LVEDV依次升高,LVEF依次降低,且Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組CHF患者的心室重構(gòu)率明顯高于Ⅰ~Ⅱ 級(jí)組患者,CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平與LVMI、LVEDV呈負(fù)相關(guān),而與LVEF呈正相關(guān),血清PDGF水平與LVMI、LVEDV呈正相關(guān),而與LVEF呈負(fù)相關(guān),同時(shí)發(fā)現(xiàn)心室重構(gòu)亞組CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平明顯低于非心室重構(gòu)亞組,血清PDGF水平明顯高于非心室重構(gòu)亞組(均P<0.05)。以上結(jié)果表明CHF患者血清miRNA-29b相對(duì)表達(dá)水平降低、PDGF水平升高可能與心室重構(gòu)有關(guān)。
綜上所述,CHF患者血清miRNA-29b表達(dá)下調(diào),而PDGF水平升高,兩者與病情嚴(yán)重程度及心室重構(gòu)關(guān)系密切,miRNA-29b可能通過(guò)靶向調(diào)控PDGF參與CHF的發(fā)生和發(fā)展。然而本研究樣本量較少,后期應(yīng)加大樣本量進(jìn)一步對(duì)miRNA-29b、PDGF在CHF及心室重構(gòu)中的具體作用機(jī)制進(jìn)行探討。