微小RNA-21對膿毒癥急性肺損傷小鼠肺組織的修復(fù)作用及其與PTEN的關(guān)系

葛晨，劉俊行，付優(yōu)，賈麗靜，龍玲，杜全勝

1河北省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，石家莊050000；2河北省兒童醫(yī)院骨科

膿毒癥是由感染誘發(fā)的宿主炎癥失調(diào)反應(yīng)，可導(dǎo)致進行性器官功能障礙，其中最早受損的臟器是肺臟[1]，臨床上表現(xiàn)為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征。流行病學(xué)研究顯示，膿毒癥患者中急性肺損傷的發(fā)生率達(dá)40%，病死率高達(dá)40%～50%[2]。膿毒癥急性肺損傷的病理機制復(fù)雜，包括炎癥因子釋放、氧化應(yīng)激、免疫失調(diào)等。膿毒癥導(dǎo)致免疫細(xì)胞群體性過度活化，引起炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)等過度釋放，大量炎癥細(xì)胞聚集到肺部，導(dǎo)致急性肺損傷[3]。同時，在膿毒癥全身炎癥反應(yīng)過程中，炎癥細(xì)胞被激活，合成和分泌大量活性氧，造成體內(nèi)氧化—還原失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)，損傷機體細(xì)胞、組織和器官，最終發(fā)展為器官功能障礙和衰竭。氧化應(yīng)激反應(yīng)與炎癥反應(yīng)相互影響，相互促進，形成炎癥—氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)[4]。微小RNA(miRNA)是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，它通過抑制靶基因翻譯調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，廣泛參與人體生長、分化、免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)等生理過程，其表達(dá)及功能失調(diào)與心血管疾病、腫瘤、膿毒癥等疾病密切相關(guān)[5-6]。研究顯示，微小RNA-21(miR-21)在炎癥疾病中發(fā)揮調(diào)控作用[7]，并可通過負(fù)向調(diào)節(jié)磷脂酶和張力蛋白同源物(PTEN)影響細(xì)胞分化、生長和凋亡[8-10]。然而，目前miR-21與膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷是否相關(guān)尚不清楚。2019年9月—2020年3月，我們通過建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型，觀察小鼠肺組織中miR-21的表達(dá)情況，并用腺病毒轉(zhuǎn)染方法干預(yù)miR-21表達(dá)，觀察其對肺水腫、血清炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，及其與PTEN的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性昆明小鼠96只，體質(zhì)量(30±5)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于清潔級動物房，飼養(yǎng)條件為明暗12 h/12 h交替，溫度18～22 ℃，濕度40%～60%，自由進食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 載有miR-21前體或抑制劑的腺病毒(美國invitrogen公司)，PTEN抑制劑(Sigma公司，美國)，小鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科科技公司)，小鼠活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TRIzol提取液(美國Ambion公司)，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國GeneCopoeia公司)，RT-PCR試劑盒(美國GeneCopoeia公司)，PTEN抗體和羊抗兔抗體(美國KPL公司)。血氣分析儀(Premier 3000, 意大利GEM公司)，低溫離心機(德國Eppendorf公司)，紫外分光光度儀(日本Shimadzu公司)，反轉(zhuǎn)錄儀(美國ABI公司)，Real-time PCR System(美國ABI公司)。

1.2 動物分組干預(yù)與模型制備 采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為假手術(shù)組(n=32)、模型組(n=32)、miR-21前體組(MP組，n=8)、miR-21抑制劑組(MI組，n=8)、miR-21前體+PTEN抑制劑組(MP+Anti-PTEN組，n=8)、miR-21抑制劑+PTEN抑制劑組(MI+Anti-PTEN組，n=8)。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥急性肺損傷模型。小鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg進行麻醉。仰臥位固定，腹部備皮、消毒，沿腹正中線切開腹壁約1.0 cm切口，探查分離盲腸，用18號無菌注射器針頭貫穿盲腸3次，后將穿刺盲腸還納至腹腔，并逐層縫合腹部切口。假手術(shù)組僅開腹后探查盲腸，不進行穿刺處理；模型組采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥急性肺損傷模型；MP組、MI組于造模前4 d分別經(jīng)尾靜脈注入載有miR-21前體和miR-21抑制劑的腺病毒0.2 mL(1×109pfu/mL)；MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組于造模前4 d分別轉(zhuǎn)染miR-21前體、miR-21抑制劑，于造模前30 min給予尾靜脈注射10 μg/kg PTEN抑制劑。

1.3 氧合指數(shù)(OI)測算 造模后24 h，每組各取8只小鼠，麻醉開腹，腹主動脈取血1 mL，使用血氣分析儀進行血氣分析，以氧分壓/吸入氧濃度計算OI。

1.4 肺組織濕重/干重比值(W/D)測定 完成血氣分析后，取小鼠左肺組織，用吸水紙吸干，置于電子天平稱重，記錄肺濕重；將肺組織置于70 ℃恒溫烘箱干燥48 h再次稱重，記錄肺干重，計算肺W/D。

1.5 血清炎癥因子TNF-α、IL-6和氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、SOD檢測 造模后24 h，取小鼠腹主動脈血2 mL，靜置后4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃保存。采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，測定樣品吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

1.6 肺組織miR-21表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。取假手術(shù)組、模型組造模后6、12、24、48 h 各8只小鼠右肺組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于肺組織miR-21表達(dá)檢測；取凍存的肺組織，應(yīng)用TRIzol提取肺組織RNA，使用超微量紫外分光光度計檢測純度和濃度，獲得高質(zhì)量RNA。按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。miR-21引物序列：上游5′-GAAATGCCTCACAGCTATCGT-3′，下游5′-CCTCCA-CAAAGAGCCACC-3′。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達(dá)量。

1.7 干預(yù)miR-21表達(dá)對PTEN蛋白表達(dá)的調(diào)控作用觀察 取假手術(shù)組、模型組、MP組、MI組造模后24 h的右肺組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于檢測miR-21及PTEN蛋白表達(dá)。miR-21檢測方法參照“1.6”，PTEN蛋白檢測采用Western blotting法。取凍存的肺組織，稱取100 mg，加入裂解液后充分勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取100 μg蛋白樣品，加入上樣緩沖液，沸水變性5 min，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入PTEN抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次15 min。加入羊抗兔抗體(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯色，用Image J軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白的灰度值與GAPDH的灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組OI比較 假手術(shù)組、模型組、MP組、MI組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組OI分別為295±28、180±19、225±21、125±13、262±25、256±26。與假手術(shù)組比較，模型組OI降低(P<0.05)；與模型組比較，MP組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組OI均升高，MI組OI降低(P均<0.05)；與MP組比較，MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組OI升高(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN組與MI+Anti-PTEN組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組肺W/D比較 假手術(shù)組、模型組、MP組、MI組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組肺W/D分別為4.0±0.4、7.3±0.7、6.1±0.5、9.6±0.8、4.8±0.5、4.9±0.5。與假手術(shù)組比較，模型組W/D升高(P<0.05)；與模型組比較，MP組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組W/D均下降，MI組W/D升高(P均<0.05)；與MP組比較，MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組W/D下降(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN組與MI+Anti-PTEN組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平升高(P均<0.05)；與模型組比較，MP組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平下降(P均<0.05)，MI組TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平升高(P均<0.05)；與MP組比較，MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平下降(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN組與MI+Anti-PTEN組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組造模后24 h血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比較

2.4 模型組造模后不同時間點肺組織miR-21表達(dá)變化 造模后6、12、24、48 h，模型組miR-21表達(dá)均較假手術(shù)組升高，造模后24 h達(dá)到峰值。見表2。

表2 假手術(shù)組和模型組造模后不同時間點肺組織miR-21表達(dá)比較

2.5 干預(yù)miR-21表達(dá)對PTEN蛋白表達(dá)的調(diào)控作用 與假手術(shù)組比較，模型組和MP組miR-21表達(dá)均升高、PTEN蛋白表達(dá)均下降，MI組miR-21表達(dá)下降、PTEN蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)；與模型組比較，MP組miR-21表達(dá)升高、PTEN蛋白表達(dá)下降，MI組miR-21表達(dá)下降、PTEN蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)。

表3 干預(yù)miR-21表達(dá)對PTEN蛋白表達(dá)的調(diào)控作用

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在膿毒癥中表達(dá)異常，其中miR-122、miR-133a、miR-146a變化較為顯著，逐步成為早期診斷膿毒癥的生物標(biāo)志物，在膿毒癥防治中發(fā)揮重要作用[11-13]。研究表明，miR-21參與多種疾病的炎癥反應(yīng)，且存在抗炎作用。miR-21在過氧化氫誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡中起保護作用[14]，在動物試驗中證實可以減輕高氧性肺損傷[15]。而miR-21在膿毒癥急性肺損傷中的表達(dá)及如何發(fā)揮作用仍未可知。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥急性肺損傷小鼠造模后6、12、24、48 h時miR-21表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，24 h達(dá)到峰值，提示miR-21參與了膿毒癥急性肺損傷的過程。我們對小鼠通過注射載有miR-21前體或抑制劑的腺病毒干預(yù)miR-21表達(dá)，結(jié)果顯示，MP組肺組織miR-21表達(dá)較模型組升高，MI組肺組織miR-21表達(dá)較模型組下降。與模型組比較，MP組OI升高，W/D下降，MI組OI降低，W/D升高，表明增加miR-21表達(dá)可減輕膿毒癥小鼠肺損傷，而抑制miR-21表達(dá)會加重膿毒癥小鼠肺組織損傷。

在膿毒癥急性肺損傷的發(fā)病及病理過程中，免疫反應(yīng)導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)過度釋放。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早的炎癥介質(zhì)，能激發(fā)炎癥瀑布效應(yīng)，促使IL-6、活性氧合成和釋放，加重炎癥反應(yīng)；TNF-α可以損傷肺毛細(xì)血管細(xì)胞，增加血管通透性，導(dǎo)致肺水腫；還可通過直接損傷Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，肺泡表面活性物質(zhì)減少，進而出現(xiàn)肺泡萎陷[16]，臨床出現(xiàn)頑固性低氧血癥、難治性呼吸困難、紫紺等癥狀。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，MP組血清TNF-α、IL-6水平下降，MI組TNF-α、IL-6水平升高，說明上調(diào)miR-21表達(dá)可減輕膿毒癥小鼠機體炎癥反應(yīng)。既往研究表明，多種miRNA通過抑制炎癥因子受體mRNA表達(dá)以減少炎癥介質(zhì)的釋放[17]，提示miR-21可能通過與炎癥通路中mRNA結(jié)合促其降解，抑制炎癥反應(yīng)，進一步改善臨床癥狀。

在膿毒癥發(fā)病過程中，除過度炎癥反應(yīng)外，氧化應(yīng)激也是膿毒癥急性肺損傷的重要發(fā)病機制之一，并且與炎癥反應(yīng)相互促進。大量炎癥因子激活炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致大量活性氧合成和分泌，形成氧化應(yīng)激狀態(tài)。氧化應(yīng)激對脂類、蛋白質(zhì)產(chǎn)生強氧化作用，而這些物質(zhì)是穩(wěn)定細(xì)胞器和生物膜的重要成分，機體細(xì)胞的過氧化損傷導(dǎo)致組織缺血、水腫，造成組織器官損傷，進一步發(fā)展為器官功能障礙和衰竭。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，MP組血清ROS、SOD水平下降，MI組血清ROS、SOD水平升高。表明增加miR-21表達(dá)可減輕膿毒癥相關(guān)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制miR-21表達(dá)后炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)增加。miR-21可能通過減輕膿毒癥相關(guān)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕炎癥因子及活性氧對肺毛細(xì)血管細(xì)胞及Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的損傷，增加肺泡表面活性物質(zhì)的釋放，進而減輕肺水腫及肺泡萎陷，使W/D下降、OI升高，改善呼吸困難及低氧血癥。

關(guān)于人類癌癥基因的研究顯示，PTEN是miR-21-5p的靶基因，miR-21-5p通過抑制PTEN進而抑制蛋白激酶B(Akt)通路，促進巨噬細(xì)胞極化和肺癌細(xì)胞凋亡。有研究認(rèn)為，miR-21-5p可作用于PTEN/Akt信號通路，抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡，進而保護肺組織[15]。Akt是一個重要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而PTEN是一種雙蛋白脂質(zhì)磷酸酶，可負(fù)性調(diào)節(jié)Akt信號通路。本研究通過觀察miR-21變化對PTEN表達(dá)的影響，分析二者之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組PTEN表達(dá)下降；MP組上調(diào)miR-21后PTEN表達(dá)下降，而MI組下調(diào)miR-21表達(dá)后PTEN表達(dá)增加。這表明在小鼠膿毒癥急性肺損傷中PTEN是miR-21的作用靶點。為進一步驗證PTEN的作用，本研究采用PTEN抑制劑降低PTEN蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與MP組造模后24 h比較，MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、W/D下降，OI升高，說明抑制PTEN后miR-21對減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、改善肺損傷的作用更強，產(chǎn)生了累加效應(yīng)。而MP+Anti-PTEN組與MI+Anti-PTEN組TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、W/D、OI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明PTEN被抑制后，上調(diào)或下調(diào)miR-21表達(dá)對膿毒癥中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、改善肺損傷影響無差異，進一步驗證了PTEN確為miR-21的作用靶點。

綜上所述，膿毒癥小鼠急性肺損傷后肺組織中miR-21表達(dá)增加，增加miR-21表達(dá)可減輕膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激從而減輕肺損傷；而抑制miR-21表達(dá)后可加重膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激而加重肺損傷，其機制可能是通過抑制PTEN發(fā)揮保護作用。