液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒濕巾中的15 種防腐劑

朱虹，鄭增堯，徐寧，楊建英，陳曉紅，黃讓明

（廣東省汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東汕頭 515041)

濕巾富含水和營養(yǎng)物質(zhì)，極易滋生微生物，需要添加防腐劑抑制微生物的生長［1］。嬰幼兒器官發(fā)育不成熟，皮膚相對(duì)嬌嫩脆弱，過量的防腐劑易刺激嬰幼兒的粘膜和皮膚，甚至引起皮膚過敏，嚴(yán)重的還會(huì)致畸致癌［2］，因此嬰幼兒濕巾的質(zhì)量安全應(yīng)引起更大的重視。目前，歐盟、美國、加拿大等國家和地區(qū)均將人體用濕巾納入化妝品進(jìn)行監(jiān)管，中國臺(tái)灣地區(qū)也將嬰兒濕巾納入化妝品種類管理。加拿大還將消毒濕巾作為非處方藥管理。然而，中國內(nèi)地是將濕巾作為一次性使用衛(wèi)生用品進(jìn)行監(jiān)管［3–11］，對(duì)應(yīng)的兩項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27728—2011《濕巾》和GB 15979—2002 《一次性使用衛(wèi)生用品標(biāo)準(zhǔn)》中均沒有明確規(guī)定防腐劑的限量值和檢測(cè)方法，因此防腐劑是嬰幼兒濕巾質(zhì)量安全的風(fēng)險(xiǎn)之一。

目前防腐劑的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜–質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法等，主要應(yīng)用于食品和化妝品領(lǐng)域。龔越飛等［12–13］采用超高效液相色譜先后分別對(duì)9 種和7 種濕巾防腐劑進(jìn)行了檢測(cè)；潘劍婷等［14］用高效液相色譜法測(cè)定了濕巾中噻唑啉酮類防腐劑；姚幫本等［15］采用超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了濕巾中5 種異噻唑啉酮類防腐劑；趙金堯等［16］采用氣相色譜–質(zhì)譜法測(cè)定了嬰兒濕巾中16種防腐劑和抗氧化劑；萬富等［17］采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了嬰兒濕巾中9 種防腐劑；黃博能等［18］采用氣相色譜–質(zhì)譜法測(cè)定了嬰幼兒濕巾中的3 種苯扎氯銨。采用液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒濕巾中15 種防腐劑的方法尚未見報(bào)道。

筆者建立了一種液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒濕巾中15 種防腐劑的方法，該方法操作簡便，靈敏度高，可為嬰幼兒濕巾中的防腐劑檢測(cè)和嬰幼兒濕巾的產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀：QTRAP 5500 型，美國AB SCIEX 公司。

氮?dú)獍l(fā)生器：Genius 1024 型，畢克氣體儀器貿(mào)易（上海）有限公司。

電子分析天平：ME 204 型，感量為0.1 mg，梅特勒–托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

旋渦震蕩器：Kylin-Bell VORTEX–5 型，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

超聲波清洗機(jī)：SB25–12DT 型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

高速離心機(jī)：3–18KS 型，德國希格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司。

溶劑過濾裝置：配置0.22 μm 有機(jī)濾膜和水相濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：（1）芐索氯銨（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.1%）、十二烷基二甲基芐基氯化銨（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%）、十四烷基二甲基芐基氯化銨（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.7%）、十六烷基二甲基芐基氯化銨（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、甲基異噻唑啉酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%）、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.1%）、對(duì)氯間甲酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%），邁迪嘉（天津）科技有限公司；（2）甲基氯異噻唑啉酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、苯甲酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%）、4-羥基苯甲酸甲酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%）、4-羥基苯甲酸乙酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、4-羥基苯甲酸異丙酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、4-羥基苯甲酸丙酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、4-羥基苯甲酸異丁酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、4-羥基苯甲酸丁酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%），美國A ChemTek 公司。

甲醇：HPLC 級(jí)，瑞典歐森巴克化學(xué)公司。

氮?dú)猓嘿|(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，由氮?dú)獍l(fā)生器制備。

針式過濾器：0.22 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

嬰幼兒濕巾樣品：市售。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 樣品預(yù)處理

將樣品剪碎成面積不大于5 mm×5 mm 的小塊，稱取2.0 g（精確至0.001 g）于15 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入50%甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)，下同）10.0 mL，在旋渦振蕩器上高速旋渦30 s，充分混勻，超聲提取20 min，以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，準(zhǔn)確移取1.0 mL 上清液于10 mL 容量瓶中，用10%甲醇溶液定容至標(biāo)線，搖勻，過0.22 μm 濾膜，進(jìn)行液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜分析。若樣品溶液濃度過高，可用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇溶液稀釋。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取15 種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，分別制備成1.0 mg/mL 的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液相應(yīng)體積至10 mL 容量瓶中，用10%甲醇溶液稀釋并定容，配制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱［100 mm×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技（上海）有限公司］；流動(dòng)相：A 相為水，B 相為甲醇，A、B 相均含有5.0 mmol/L 甲酸銨和0.01%甲酸，流量為0.3 mL/min，梯度淋洗條件見表1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

表1 梯度淋洗程序1）

1.3.2 質(zhì)譜

離子源：電噴霧（ESI）；掃描方式：正源和負(fù)源同時(shí)掃描；離子源噴霧電壓（IS）：正源為5 500 V，負(fù)源為– 4 500V；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源加熱溫度：550 ℃；氣簾氣（CUR）、霧化氣（GAS1）、加熱輔助氣（GAS2）、碰撞氣（CAD）均為高純氮?dú)?；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 特征選擇離子及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用正、負(fù)模式同時(shí)掃描的方式，在流動(dòng)相水–甲醇體系中加入甲酸銨可增大目標(biāo)組分的響應(yīng)值。分別考察了目標(biāo)組分在濃度為2.0、5.0、10 mmol/L 的甲酸銨溶液中的響應(yīng)值，結(jié)果表明流動(dòng)相中含有5.0 mmol/L 甲酸銨時(shí)目標(biāo)組分的離子化程度最高。同時(shí)甲酸銨溶液中含有0.1%甲酸溶液時(shí)色譜峰形得到顯著改善，因此采用水–甲醇（水和甲醇均含有5.0 mmol/L 甲酸銨和0.01%甲酸溶液）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。15 種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為100 ng/mL）的總離子色譜圖見圖1 和圖2。

圖1 6 種防腐劑的總離子色譜圖（正模式）

圖2 9 種防腐劑的總離子色譜圖（負(fù)模式）

2.2 提取條件的選擇和優(yōu)化

根據(jù)15 種防腐劑的化學(xué)性質(zhì)和嬰幼兒濕巾的基質(zhì)特點(diǎn)，采用有機(jī)溶劑直接提取的方式進(jìn)行樣品處理。分別考察了30%、50%、80%甲醇溶液的提取效果，結(jié)果表明，3 種不同濃度的甲醇溶液對(duì)15 種防腐劑提取效果均較好，其中以50%甲醇溶液的提取率最高，因此選取50%的甲醇溶液作為提取溶劑。

為進(jìn)一步提高目標(biāo)組分的提取率，確保方法的穩(wěn)定性，采取樣品旋渦混勻后超聲提取的方式。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間超過20 min 以后，各組分的提取率再無明顯提高。因而選取超聲時(shí)間為20 min。在實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，提取液直接進(jìn)樣，保留時(shí)間較短的甲基異噻唑啉酮色譜峰形較差，色譜響應(yīng)值會(huì)受溶劑效應(yīng)的影響。當(dāng)將提取液用10%甲醇溶液稀釋后進(jìn)樣時(shí)，由于10%甲醇溶液與初始流動(dòng)相組成相近，甲基異噻唑啉酮色譜峰形尖銳，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。因此樣品提取液采用10%甲醇溶液稀釋后進(jìn)樣，系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液也用10%甲醇溶液配制。

2.3 線性方程和檢出限

在1.3 儀器工作條件下，對(duì)15 種防腐劑的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以各組分質(zhì)量濃度為自變量、定量離子色譜峰面積為因變量進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以空白樣品的3 倍信噪比計(jì)算檢出限［19］，以10 倍信噪比計(jì)算定量限。15 種防腐劑質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限列于表3。由表3 可知，在對(duì)應(yīng)的線性范圍內(nèi)，各目標(biāo)組分的線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.996～0.999 8，方法檢出限為0.000 1～2 mg/kg。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取經(jīng)檢測(cè)不含15 種防腐劑的嬰幼兒濕巾樣品，分別添加高、低兩個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表4。由表4 可知，在高、低兩種濃度的加標(biāo)水平下，15 種防腐劑的平均回收率為83.4%～102.9%。6 次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～4.9%，表明本方法精密度、準(zhǔn)確度均較高。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)語

建立了液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定嬰幼兒濕巾中的15 種防腐劑的方法，該方法操作簡便，特異性好，回收率高，靈敏度和準(zhǔn)確度及檢測(cè)時(shí)間均能滿足工業(yè)生產(chǎn)過程的檢測(cè)要求。該法可為強(qiáng)化嬰幼兒濕巾的安全監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。