白術(shù)多糖對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激的作用

鞏克民， 季宏建

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224005；2.鹽城市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 鹽城 224005)

動(dòng)脈粥樣硬化是心肌梗死和腦卒中的發(fā)病基礎(chǔ)，其基本的病理表現(xiàn)為血管壁彈性下降、血管內(nèi)膜損傷、修復(fù)、增厚及其導(dǎo)致的管腔狹窄，繼而引發(fā)靶器官的缺血缺氧損傷，最終引發(fā)一系列嚴(yán)重疾病[1]。內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展[2]，VSMCs在新生內(nèi)膜的大量積聚是血管中膜平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜并大量增殖造成，有效抑制VSMCs的活化及增殖可能是防治動(dòng)脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)[3]。而氧化應(yīng)激是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要促進(jìn)因素之一，主要通過(guò)氧化修飾作用，誘導(dǎo)血管基因表達(dá)、促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)和VSMCs增殖，從多方面參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[4]。

中藥多糖是一種來(lái)源廣泛、無(wú)毒副作用的天然的大分子化合物，具有多種生物活性和多種藥理作用。有研究報(bào)道[5-7]，多糖能夠減輕腦缺血造成的神經(jīng)功能損傷，抑制神經(jīng)元凋亡，降低模型大鼠腦組織中的NO水平和NOS活性，表現(xiàn)出明顯的抗氧化應(yīng)激損傷活性，發(fā)揮腦組織保護(hù)作用；同時(shí)也有研究報(bào)道[8-9]，多糖能夠減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，保護(hù)血管內(nèi)膜從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化的形成。白術(shù)多糖作為白術(shù)的主要生物活性成分之一，已經(jīng)在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面被廣泛地使用[10]。但是關(guān)于白術(shù)多糖在心腦血管方面的應(yīng)用研究極少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察白術(shù)多糖對(duì)血管緊張素Ⅱ (angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)誘導(dǎo)的VSMCs增殖及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，以期為白術(shù)多糖應(yīng)用于臨床腦血管病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 8周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠，由江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇) 2019-0036。

1.2 藥物 白術(shù)多糖購(gòu)于陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號(hào)CY190105，純度≥98%，深棕色粉末狀，極易溶于水，雙蒸水配制成20 mg/L貯備液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝并貯存于常溫備用。

1.3 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和青-鏈霉素均購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；Ang-Ⅱ購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；p-p38、c-Myc、β-actin抗體均購(gòu)于美國(guó)R&D公司；PE-BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；p38MAPK抑制劑SB203580、ROS活性氧檢測(cè)試劑盒、SOD和MDA試劑盒均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 大鼠胸主動(dòng)脈VCMCs的分離及培養(yǎng) 2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，在無(wú)菌條件下取出胸主動(dòng)脈，剔除血管外膜和內(nèi)膜后，將血管段剪成1 mm2大小的組織塊，均勻鋪在培養(yǎng)瓶底部，加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待觀察到組織塊周圍的細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第4～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 分組處理 取第4～5代VCMCs細(xì)胞分為5組，對(duì)照組，VCMCs細(xì)胞不經(jīng)過(guò)任何處理，正常培養(yǎng)；Ang-Ⅱ組，采用0.1 μmol/L Ang-Ⅱ處理VCMCs 24 h[11]；Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組，采用0.1 μmol/L Ang-Ⅱ刺激24 h，80 μg/mL白術(shù)多糖處理VCMCs 48 h；Ang-Ⅱ+SB203580組，采用10 μmol/L p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理2 h[12]，0.1 μmol/L Ang-Ⅱ刺激24 h；Ang-Ⅱ+ SB203580+白術(shù)多糖組，依次采用10 μmol/L p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理2 h，0.1 μmol/L Ang-Ⅱ刺激24 h，80 μg/mL白術(shù)多糖處理48 h。

2.3 MTT比色法檢測(cè)VCMCs細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期VCMCs細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞種于96孔板，先采用0.1 μmol/L Ang-Ⅱ誘導(dǎo)刺激24 h，再采用不同質(zhì)量濃度(0、20、40、80、160 μg/mL)的白術(shù)多糖分別處理24、48、72 h。吸取培養(yǎng)液，取出不同分組的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加20 μL MTT 溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸掉上清，每孔加入150 μL DMSO溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔光密度(OD490)表示細(xì)胞活力。

2.4 BrdU法檢測(cè)VCMCs細(xì)胞增殖情況 VCMCs細(xì)胞分組處理后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作和BrdU標(biāo)記，加入PE-BrdU抗體，4 ℃避光孵育30 min。使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、575 nm發(fā)射波長(zhǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比表示細(xì)胞增殖情況。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平 培養(yǎng)VCMCs細(xì)胞，分組處理后收集細(xì)胞沉淀，重懸后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針避光孵育30 min，PBS洗滌3次，使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以相對(duì)平均熒光強(qiáng)度值表示細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.6 細(xì)胞內(nèi)SOD活性及MDA水平檢測(cè) 培養(yǎng)VCMCs細(xì)胞，分組處理后收集細(xì)胞沉淀，冰水浴條件下裂解細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA水平，羥胺法測(cè)定T-SOD活性。

2.7 Western blot檢測(cè)p-p38和c-Myc的蛋白表達(dá) 培養(yǎng)VCMCs細(xì)胞，分組處理后收集細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)各組蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，再將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，洗膜，加入一抗稀釋液(c-Myc、p-p38和β-actin，1∶1 000)，室溫孵育1 h，洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG(1∶20 000)，室溫孵育1 h，洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，于暗室中顯影分析。

3 結(jié)果

3.1 白術(shù)多糖對(duì)暴露于Ang-Ⅱ條件下VCMCs細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，與對(duì)照組比較，Ang-Ⅱ作用24、48、72 h均可提高VCMCs細(xì)胞增殖活性(P<0.05)；與Ang-Ⅱ處理組比較，80、160 μg/mL白術(shù)多糖處理48、72 h均可抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的VCMCs細(xì)胞活力增強(qiáng)(P<0.05)。綜合考慮，選擇80 μg/mL白術(shù)多糖處理48 h作為實(shí)驗(yàn)條件。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖(0 μg/mL)組比較，#P<0.05。圖1 不同質(zhì)量濃度白術(shù)多糖對(duì)VCMCs細(xì)胞活力的影響

3.2 白術(shù)多糖抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的VCMCs細(xì)胞增殖 如圖2所示，與對(duì)照組比較，Ang-Ⅱ組VCMCs細(xì)胞增殖水平增加(P<0.05)；與Ang-Ⅱ組比較，Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組和Ang-Ⅱ+SB203580組VCMCs細(xì)胞增殖水平降低(P<0.05)；與Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組比較，Ang-Ⅱ+SB203580組和Ang-Ⅱ+SB203580+白術(shù)多糖組VCMCs細(xì)胞增殖水平降低(P<0.05)；Ang-Ⅱ+SB203580組、Ang-Ⅱ+SB203580+白術(shù)多糖組VCMCs細(xì)胞增殖水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。

3.3 白術(shù)多糖對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)條件下VCMCs細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 如圖3所示，與對(duì)照組比較，Ang-Ⅱ組VCMCs細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平增加(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與Ang-Ⅱ組比較，Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組和Ang-Ⅱ+ SB203580組VCMCs細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性增加(P<0.05)；與Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組比較，Ang-Ⅱ+SB203580組和Ang-Ⅱ+SB203580+白術(shù)多糖組VCMCs細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性增加(P<0.05)；與Ang-Ⅱ+SB203580組比較，Ang-Ⅱ+SB203580+白術(shù)多糖組VCMCs細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平以及SOD活性均無(wú)明顯變化(P>0.05)。

3.4 白術(shù)多糖對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)條件下VCMCs細(xì)胞內(nèi)p-p38和c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響 如圖4所示，與對(duì)照組比較，Ang-Ⅱ組VCMCs細(xì)胞內(nèi)p-p38和c-Myc蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05)；與Ang-Ⅱ組比較，Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組和Ang-Ⅱ+SB203580組VCMCs細(xì)胞p-p38和c-Myc蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組比較，Ang-Ⅱ+SB203580組和Ang-Ⅱ+SB203580+白術(shù)多糖組VCMCs細(xì)胞p-p38和c-Myc蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與Ang-Ⅱ+SB203580組比較，Ang-Ⅱ+ SB203580+白術(shù)多糖組VCMCs細(xì)胞內(nèi)p-p38和c-Myc蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。

注：A為ROS水平， B為SOD活性，C為MDA水平。與對(duì)照組比較，*P<0.05, **P<0.01；與Ang-Ⅱ組比較，#P<0.05；與Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組比較，■P<0.05。圖3 白術(shù)多糖對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)條件下VCMCs細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平及SOD活性的影響

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與Ang-Ⅱ組比較，#P<0.05；與Ang-Ⅱ+白術(shù)多糖組比較，■P<0.05。圖4 白術(shù)多糖對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)條件下VCMCs細(xì)胞內(nèi)p-p38和c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等心血管疾病最常見(jiàn)的血管病理改變，一直是心血管領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。而VSMCs的異常增殖在動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成過(guò)程中起到重要作用[13]。Ang-Ⅱ作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的重要功能因子，可以通過(guò)自分泌和旁分泌方式作用于VSMCs，刺激VSMCs增殖，且具有劑量依賴性[14]。因此，阻斷Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs異常增殖可能成為預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，Ang-Ⅱ刺激能夠誘導(dǎo)VSMCs增殖并產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而白術(shù)多糖處理可抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞增殖，并提高細(xì)胞抗氧化能力，并且其作用機(jī)制可能與抑制p38 MAPK通路激活有關(guān)，提示該藥可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)心血管疾病的治療具有一定的療效。

氧化應(yīng)激是機(jī)體抗氧化反應(yīng)與氧化反應(yīng)之間的一種失控狀態(tài)，機(jī)體組織中ROS生成過(guò)多是導(dǎo)致血管并發(fā)癥產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)，從多方面參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[15]。已有研究表明[16]，氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ROS形成可促進(jìn)細(xì)胞因子分泌和相應(yīng)受體表達(dá)引起慢性炎癥反應(yīng)和VSMCs增殖。因此，減少ROS的產(chǎn)生以及提高VSMCs抗氧化水平或許是治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的重要途徑?，F(xiàn)有的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物長(zhǎng)期服用，均可導(dǎo)致不同程度的不良反應(yīng)發(fā)生，故從天然植物藥中尋找有效的抗動(dòng)脈粥硬化藥物成分是目前研究的熱點(diǎn)。白術(shù)多糖是從白術(shù)根莖中提取出的多糖類，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、抗衰老、調(diào)節(jié)胃腸等多重藥理作用。已有研究證實(shí)[17]，白術(shù)可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和RAAS的活化改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心室重構(gòu)。提示，白術(shù)多糖可能對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs增殖及氧化應(yīng)激具有一定的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，Ang-Ⅱ可誘導(dǎo)VSMCs增殖，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平增加，SOD活性降低，說(shuō)明Ang-Ⅱ可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化水平增加進(jìn)而促進(jìn)VSMCs增殖。然而Ang-Ⅱ處理一段時(shí)間后再采用白術(shù)多糖干預(yù)，結(jié)果顯示VSMCs增殖被抑制，且胞內(nèi)ROS、MDA水平下降，而SOD活性上升。表明，白術(shù)多糖對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和VSMCs增殖具有抑制作用，而有效抑制VSMCs增殖可能是臨床上防治動(dòng)脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)。

p38 MAPK是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的表達(dá)調(diào)控，具有多種生物學(xué)功能。多項(xiàng)研究表明[18-19]，p38 MAPK通路參與血管損傷后內(nèi)膜增生過(guò)程。Wang等[20]研究顯示，AngⅡ能通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)VSMCs增殖，抑制p38 MAPK信號(hào)通路活化可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖。同時(shí)，Jeong等[21]研究表明，白術(shù)復(fù)合物可抑制p38 MAPK信號(hào)通路活化。提示，白術(shù)多糖有可能通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路活化進(jìn)而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖和氧化應(yīng)激。為探討白術(shù)多糖是否對(duì)AngⅡ激活的p38 MAPK通路產(chǎn)生影響，本研究對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，Ang-Ⅱ干預(yù)可誘導(dǎo)VSMCs中p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-p38和c-Myc蛋白的表達(dá)，采用p38 MAPK抑制劑SB203580干預(yù)可以抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的p38 MAPK信號(hào)通路活化，VSMCs增殖及氧化應(yīng)激，表明抑制p38 MAPK信號(hào)通路活化可抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs增殖及氧化應(yīng)激。此外，本研究還顯示，采用白術(shù)多糖干預(yù)對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的p38 MAPK信號(hào)通路活化具有抑制作用，然而白術(shù)多糖與SB203580聯(lián)合干預(yù)并沒(méi)有對(duì)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs增殖及氧化應(yīng)激出現(xiàn)疊加抑制效果，說(shuō)明白術(shù)多糖是通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs增殖和氧化應(yīng)激。

綜上所述，白術(shù)多糖可能通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路的激活，降低VSMCs細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA的生成，提高SOD活性，從而抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，本研究結(jié)果為白術(shù)多糖對(duì)AS相關(guān)心血管疾病的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為其應(yīng)用于臨床腦血管病的防治提供了理論基礎(chǔ)。