白術(shù)多糖通過TLR4信號通路對結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫調(diào)節(jié)的影響

馮子芳， 楊瑞賓

(興義市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，貴州 興義 562400)

結(jié)腸癌是一種全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高，發(fā)展極為迅速的惡性腫瘤之一。根據(jù)2000至2014年全球癌癥生存趨勢監(jiān)測計劃(CONCORD計劃)第三階段的調(diào)查數(shù)據(jù)[1]顯示，我國結(jié)腸癌發(fā)病率高居所有癌癥第3位，其5年生存率僅有 57.6%，遠低于韓國、日本等亞洲其他國家。機體免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)腫瘤免疫應(yīng)答，改變腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，但大多數(shù)腫瘤細胞因機體免疫功能低下而逃逸免疫監(jiān)控，最終表現(xiàn)出“免疫逃逸”的現(xiàn)象，這也是導(dǎo)致放化療后腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[2]。因此，增強機體免疫功能將有助于提高機體的抗腫瘤效果。隨著中醫(yī)藥臨床價值逐漸被世界認可，傳統(tǒng)中藥因其顯著的藥理作用，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中備受關(guān)注。白術(shù)多糖是中藥白術(shù)的主要藥效成分之一，其具有抗氧化、保肝、抗炎、抗過敏、抗血栓、抗病毒、抗癌等多種藥理作用[3]。并且有研究顯示[4-5]，白術(shù)多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，能提高機體免疫功能。然而，白術(shù)多糖是否通過調(diào)控機體免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，目前鮮有報道。本研究采用結(jié)腸癌CT26細胞荷瘤小鼠模型，探討白術(shù)多糖干預(yù)對荷瘤小鼠腫瘤生長、免疫調(diào)節(jié)的影響及其可能機制，以期為白術(shù)多糖的臨床應(yīng)用提供更多的藥效研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與動物 小鼠結(jié)腸癌CT26細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級雌性BALB/c小鼠30 只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2014-0011。在溫度22～24 ℃，相對濕度40%～70%，通風(fēng)良好，晝夜12 h光照條件下自由飼養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 白術(shù)多糖(純度≥98%，批號CY181005)及香菇多糖(純度≥98%，批號CY181203)均購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司。小鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α；批號190201)ELISA試劑盒、小鼠白介素-2(Interleukin-2，IL-2；批號190111)ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)標記的CD3e抗體(批號561042)、藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)標記的CD4抗體(批號553653)、PE-CD8a抗體(批號553032)、異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的CD11b抗體(批號557396)和PE標記的淋巴細胞抗原6復(fù)合物G位點(Ly-6G/Gr-1)抗體(批號561104)均購自美國BD公司；兔抗小鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor，TLR4)單克隆抗體(批號14358)、兔抗人髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)單克隆抗體(批號4283)、兔抗人核因子-κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB p65)單克隆抗體(批號8242)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(批號5174)購自美國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人TNF受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)單克隆抗體(批號sc-8409)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 方法

1.3.1 建模及分組 取對數(shù)生長期的小鼠結(jié)腸癌CT26細胞，調(diào)整細胞密度至1×107/mL，接種于小鼠右前肢背部皮下，每只小鼠接種0.2 mL細胞懸液。待接種7 d左右，接種處可見平均直徑約5 mm腫瘤時視為造模成功[6]。選擇腫瘤體積無差異的荷瘤小鼠隨機分為5組，每組6只，即模型組，給予等量生理鹽水灌胃處理；陽性對照香菇多糖組，150 mg/kg香菇多糖灌胃處理；白術(shù)多糖低劑量組，125 mg/kg白術(shù)多糖灌胃處理；白術(shù)多糖中劑量組，250 mg/kg白術(shù)多糖灌胃處理；白術(shù)多糖高劑量組，500 mg/kg白術(shù)多糖灌胃處理；另選取6只正常的BALB/c小鼠作為空白對照組，給予等量生理鹽水灌胃處理，每天1次，給藥周期為21 d。給藥期間，每4 d用游標卡尺測量一次腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按照V=ab2/2計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。

1.3.2 免疫器官指數(shù)及抑瘤率測定 末次給藥24 h后，斷頸處死小鼠，稱定體質(zhì)量，在無菌條件下剝離腫瘤、脾、胸腺等組織，稱定質(zhì)量，按照以下公式計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)[7]：抑瘤率=[(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重]×100%、胸腺(脾)指數(shù)=胸腺(脾)質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.3.3 ELISA法檢測小鼠血清TNF-α及IL-2表達 采用摘眼球取血法收集各組小鼠外周血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書操作，使用酶標儀測定450 nm處吸光度，并按照說明書提供的公式計算血清TNF-α及IL-2水平。

1.3.4 流式細胞儀檢測小鼠外周血T淋巴細胞亞群 取各組小鼠外周血，加入紅細胞裂解液，600 r/min離心5 min，棄上清。PBS重懸細胞，加入APC-CD3e、PE-CD4和PE-CD8a抗體，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2次后重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。以CD3e+CD4+雙陽性細胞亞群百分比表示CD4+T細胞所占比例，以CD3e+CD8+雙陽性細胞亞群表示CD8+T細胞所占比例，并計算CD4+/CD8+比值。

1.3.5 流式細胞儀檢測腫瘤組織髓來源的抑制性細胞(Myeloid derived suppressor cells，MDSCs)水平 取各組小鼠新鮮腫瘤組織，制備成單細胞懸液，加入FITC-CD11b和PE-Gr-1抗體，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2次后重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。以Gr-1+CD11b+雙陽性細胞亞群百分比代表MDSC細胞所占比例。

1.3.6 Western blot檢測脾臟組織中TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達水平 取約20 mg各組小鼠脾臟組織，加入組織裂解液充分裂解，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量。取20 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBS洗滌3次，分別加入TLR4抗體(1∶1 000)、MyD88抗體(1∶1 000)、NF-κB p65抗體(1∶1 000)、TRAF6抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。第2天，PBS洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔或小鼠IgG(1∶10 000)室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，避光孵育1 min，顯影。相對蛋白表達量以目的蛋白光密度值/內(nèi)參蛋白光密度值表示。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 各組小鼠腫瘤生長曲線如圖1A所示，與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠腫瘤生長速度相對緩慢；從接種第20天起，白術(shù)多糖高劑量組和香菇多糖組小鼠腫瘤體積均小于模型組(P<0.05)；從接種第24天起，白術(shù)多糖中劑量組小鼠腫瘤體積均小于模型組(P<0.05)。CT26細胞接種28 d后，各組小鼠腫瘤如圖1B所示，結(jié)果如表1所示，可知白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠瘤質(zhì)量均小于模型組(P<0.05)。

表1 各組CT26荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比較

2.2 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均降低(P<0.05)；與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均增加(P<0.05)，但白術(shù)多糖低劑量組無顯著性差異(P>0.05)，如表2所示。

注：A為各組CT26荷瘤小鼠腫瘤生長曲線，B為接種CT26細胞28 d后各組荷瘤小鼠腫瘤實物圖。相同時間點與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 白術(shù)多糖抑制CT26荷瘤小鼠腫瘤生長

2.3 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠外周血T淋巴細胞亞群及腫瘤組織中MDSCs細胞水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠外周血CD4+T細胞比例以及CD4+T/CD8+T比值降低(P<0.05)，而CD8+T細胞比例升高(P<0.05)；與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠外周血CD4+T細胞比例以及CD4+T/CD8+T比值升高(P<0.05)，而CD8+T細胞比例以及腫瘤組織中MDSCs細胞比例降低(P<0.05)。同時，白術(shù)多糖低劑量組與模型組比較以上指標均無顯著性差異(P>0.05)。如表3所示。

2.4 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-2水平降低(P<0.05)；與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠血清中TNF-α、IL-2水平增加(P<0.05)，而白術(shù)多糖低劑量組兩者水平無顯著性差異(P>0.05)。如表4所示。

表2 各組CT26荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較

表3 各組CT26荷瘤小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞及腫瘤組織中MDSCs水平比較

表4 各組CT26荷瘤小鼠血清TNF-α及IL-2水平比較

2.5 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠脾臟中TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 如圖2所示，與空白對照組比較，模型組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、TRAF-6以及NF-κB p65等蛋白表達均降低(P<0.05)；與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、TRAF-6以及NF-κB p65等蛋白表達均升高(P<0.05)，而香菇多糖組、白術(shù)多糖低劑量組上述蛋白表達無明顯變化(P>0.05)。

3 討論

注：與空白對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 各組CT26荷瘤小鼠脾臟中TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達

白術(shù)多糖是從白術(shù)根莖中提取的多糖類物質(zhì)，其主要包含甘露聚糖、果聚糖等成分，其最為顯著的藥理作用是促免疫作用。例如，Ji等[8]研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖可以通過激活NF-κB信號通路，促進炎癥因子TNF-α、IFN-γ以及NO的釋放，進而活化RAW264.7巨噬細胞。Kim等[5]研究顯示，白術(shù)多糖作為一種佐劑，可以顯著增加IgG滴度，促進抗原特異性淋巴細胞增殖，從而增強胸膜肺炎放線桿菌感染小鼠機體的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)。隨著人們對白術(shù)多糖藥理研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖還具有抗腫瘤的作用，例如，F(xiàn)eng等[9]研究報道稱，白術(shù)多糖通過引起細胞周期S期阻滯，誘導(dǎo)肝癌H22細胞凋亡，并抑制H22細胞移植瘤的生長。然而，白術(shù)多糖是否通過調(diào)節(jié)機體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用目前還鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，白術(shù)多糖可以抑制CT26荷瘤小鼠腫瘤的生長，其在250、500 mg/kg劑量下的抑瘤率分別達到40.85%和65.11%。同時，白術(shù)多糖可以通過活化TLR4信號通路，促進炎癥因子TNF-α及IL-2釋放，提高CD4+/CD8+比值，降低腫瘤組織中MDSCs水平。因此，白術(shù)多糖有可能通過調(diào)節(jié)機體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。

眾所周知，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中常伴隨著機體免疫功能的降低，甚至逃逸機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，然而腫瘤的發(fā)生可引起機體免疫器官的萎縮[10]，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的高低在一定程度上可以反應(yīng)機體免疫功能的強弱。本研究結(jié)果表明，中、高劑量白術(shù)多糖干預(yù)可以提高CT26荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，說明白術(shù)多糖可以增強荷瘤小鼠的免疫功能。在機體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中，T淋巴細胞發(fā)揮重要作用，其中輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞(CD3+CD4+)主要分泌TNF-α、IL-2等細胞因子，刺激或增強細胞、體液免疫應(yīng)答；而抑制細胞毒T淋巴細胞(CD3+CD8+)主要通過分泌抑制因子抑制細胞毒性T淋巴細胞和B淋巴細胞活化，起負調(diào)控作用。臨床研究數(shù)據(jù)顯示[11]，腫瘤患者常出現(xiàn)CD3+CD4+細胞亞群明顯減少，CD3+CD8+細胞亞群明顯升高，以及CD4+/CD8+比值明顯降低的現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量白術(shù)多糖干預(yù)可提高荷瘤小鼠血液中CD3+CD4+細胞亞群比例，降低CD3+CD8+細胞亞群比例，從而提高CD4+/CD8+比值。與此同時，中、高劑量白術(shù)多糖干預(yù)還可促進荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2等細胞因子的分泌，進一步激活機體免疫功能。此外，MDSC是一種重要的免疫抑制細胞，腫瘤組織中存在大量的MDSCs，其可以通過多種途徑抑制T細胞的活化，并對腫瘤細胞適應(yīng)性生長起到促進作用[12]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量白術(shù)多糖干預(yù)可以降低荷瘤小鼠腫瘤組織中MDSC細胞水平。說明，白術(shù)多糖可能通過降低MDSCs水平，減少其對T細胞的影響，并通過分泌TNF-α、IL-2等細胞因子刺激T細胞的活化，以達到提高機體免疫力的功效，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類天然免疫模式識別受體，常表達于免疫細胞表面，能夠激活機體天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[13]。TLRs信號通路主要由MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑組成，而TRAF-6是這兩條途徑的交叉點，繼而激活NF-κB途徑，誘導(dǎo)促炎因子的釋放，最終促進淋巴細胞的增殖及活化。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量白術(shù)多糖可上調(diào)荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、TRAF-6以及NF-κB p65等蛋白表達，表明白術(shù)多糖能夠激活TLR4信號通路。提示，白術(shù)多糖發(fā)揮促免疫作用有可能是通過激活TLR4信號通路實現(xiàn)的。錢隆等[14]研究結(jié)果也顯示，白術(shù)多糖能夠激活TLR4信號通路，發(fā)揮增強免疫的作用。此外，作為陽性對照香菇多糖對TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達無顯著影響，可能是由于香菇多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤作用的機制不是通過該信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實白術(shù)多糖具有調(diào)節(jié)結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠免疫功能及抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，其作用機制可能與TLR4信號通路激活有關(guān)。然而，由于白術(shù)多糖具有多種藥理作用，在本研究中其是否還通過其他途徑發(fā)揮抗腫瘤作用？還需進一步深入研究。