紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)鑒別懸鉤木主流品種

王柯入， 王成輝， 李子儀， 林 菁， 徐鑫鵬， 古 銳*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

藏藥懸鉤木始載于藏醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作《月王藥診》[1]，來(lái)源于薔薇科懸鉤子屬多種植物，具有治療風(fēng)熱病、熱性時(shí)疫的功效，特效于肺病，是藏醫(yī)治療瘟疫、感冒的要藥，《中國(guó)藥典》《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)》《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》等[2-6]記載有25個(gè)相關(guān)制劑用于臨床。文獻(xiàn)調(diào)研和西藏、青海、四川3省實(shí)地調(diào)研表明，懸鉤木主流藥材基原為粉枝莓RubusbiflorusBuch.-Ham. ex Smith、紅泡刺藤RubusniveusThunb.和黑腺美飾懸鉤子Rubussubornatusvar.melanadenusFocke[7-10]。由于懸鉤木藥材是去皮去髓莖枝，鑒別特征嚴(yán)重缺失，難以通過(guò)藥材性狀鑒別基原；藏區(qū)懸鉤子屬植物品種多樣[11-13]，進(jìn)一步增大了懸鉤木藥材鑒別的難度。目前，關(guān)于藏藥懸鉤木藥材基原鑒別研究甚少，大多僅通過(guò)植物性狀和粉末顯微特征，但前者不適用于藥材基原鑒別，后者不明顯而難以用于藥材鑒別。

紅外光譜檢測(cè)技術(shù)預(yù)處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，在不需要化學(xué)對(duì)照品的情況下，可根據(jù)紅外圖譜對(duì)樣品化學(xué)成分進(jìn)行分析表征，反應(yīng)樣品化學(xué)成分種類(lèi)和含量的差異；結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法挖掘原始光譜中潛在信息，可達(dá)到品種鑒別的目的[14-17]，能體現(xiàn)藥材的整體性和模糊性，適合現(xiàn)有研究少、化學(xué)成分復(fù)雜的藥用植物研究。本研究采集了藏藥懸鉤木3個(gè)主流品種共19份樣品的紅外光譜信息，對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)平滑、基線校正、坐標(biāo)歸一化、二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)等處理后，采用系統(tǒng)聚類(lèi)分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)作進(jìn)一步考察，以期為該藥材鑒別提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 2019年6月至2020年9月從西藏、青海、四川、云南采集25批樣品，經(jīng)重慶市中藥研究所秦松榮教授鑒定分別為粉枝莓7批、紅泡刺藤5批、黑腺美飾懸鉤子10批、弓莖懸鉤子1批、桔紅懸鉤子1批、華中懸鉤子1批，具體見(jiàn)表1，按照《西藏自治區(qū)藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》[18]下炮制要求將其莖去皮去髓干燥，制成懸鉤木，粉碎后過(guò)200目篩。

1.2 儀器與試劑 Cary 600 傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Agilent公司)；FW-5新型紅外壓片機(jī)(天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司)；DZF-6050真空干燥箱 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BSA124S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；FW-135萬(wàn)能粉碎機(jī) (天津泰斯特儀器有限公司)。溴化鉀(成都市科隆化學(xué)品有限公司)。

2 方法

2.1 分析條件 溫度24～26 ℃；相對(duì)濕度35%～40%；粉末壓片累積掃描次數(shù)32次；掃描范圍4 000～400 cm-1；分辨率為4 cm-1。

2.2 樣品測(cè)定 采用溴化鉀壓片法，按1∶100比例稱取適量樣品粉末至瑪瑙研缽中，與干燥的KBr充分研磨，壓制成厚度約為1 mm的透明錠片，通過(guò)傅里葉紅外變換儀測(cè)定透光率，每批樣品制備3個(gè)透明錠片，每個(gè)透明錠片掃描3次。同法制備KBr空白片。

表1 樣品信息

2.3 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)OMINIC 8.2軟件對(duì)19批樣品的紅外光譜圖進(jìn)行平滑處理、基線校正、坐標(biāo)歸一化等處理，再取同一批樣品9張紅外光譜圖的平均譜圖作為紅外標(biāo)準(zhǔn)譜，對(duì)其進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，得到相應(yīng)樣品二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖；對(duì)各樣品紅外標(biāo)準(zhǔn)譜和二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖進(jìn)行比較，得到相似度；導(dǎo)出紅外標(biāo)準(zhǔn)譜和二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖的CSV格式數(shù)據(jù)及峰位、峰強(qiáng)等信息，分析特征峰。基于二階導(dǎo)數(shù)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析(HCA)，SIMCA 14.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取FZM-1適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試片，在“2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定5次，測(cè)得紅外圖譜相關(guān)系數(shù)為0.999 3～0.999 6，RSD為0.03%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取FZM-1適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試片，置于干燥器內(nèi)保存，取FZM-1適量，每隔10 min測(cè)定1次，共5次，測(cè)得紅外譜圖相關(guān)系數(shù)為0.998 4～0.999 1，RSD為0.06%，表明樣品在50 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取FZM-1適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備5份供試片，在“2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定，測(cè)得紅外譜圖相關(guān)系數(shù)為0.993 5～0.999 4，RSD為0.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 外部驗(yàn)證試驗(yàn) 取FZM-7、HP-5、HX-10和GJ、JH、HZ適量，在“2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定，進(jìn)行外部驗(yàn)證。

3 結(jié)果

3.1 紅外光譜圖 19批樣品(FZM-1、FZM-2、FZM-3、FZM-4、FZM-5、FZM-6，HP-1、HP-2、HP-3、HP-4和HX-1、HX-2、HX-3、HX-4、HX-5、HX-6、HX-7、HX-8、HX-9)紅外光譜圖相似度高，見(jiàn)圖1，難以從譜線看出不同品種之間的差別。指紋圖譜主要吸收區(qū)域在3 600～3 050、3 050～2 800、1 800～1 550、1 550～1 200、1 200～900、400～900 cm-1附近，吸收峰在1 800～400 cm-1波段內(nèi)較為密集；3 352 cm-1附近頻率低、譜帶寬的吸收峰推測(cè)是O-H的伸縮振動(dòng)峰；2 930 cm-1附近的吸收峰推測(cè)是烷烴C-H伸縮振動(dòng)峰；1 741、1 603 cm-1附近的吸收峰推測(cè)是苯環(huán)的碳骨架彎曲振動(dòng)以及C≡N、C=O、C=C等伸縮振動(dòng)；1 508 cm-1附近的吸收峰與1 603 cm-1成對(duì)出現(xiàn)，推測(cè)是苯環(huán)的伸縮振動(dòng)峰；1 459 cm-1附近的吸收峰推測(cè)是C-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰或C-O伸縮振動(dòng)峰；1 442、1 373、1 326 cm-1附近的吸收峰推測(cè)是C-H或O-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰；1 242 cm-1附近的吸收峰推測(cè)是取代苯類(lèi)C-H或0-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰；1 158、1 106、1 052 cm-1附近的的吸收峰推測(cè)推測(cè)是苷類(lèi)、多糖類(lèi)碳水化合物的C-O彎曲振動(dòng)；605 cm-1附近的吸收峰推測(cè)是烯烴的C-H彎曲振動(dòng)或苯環(huán)的彎曲振動(dòng)和面外彎曲振動(dòng)峰。

圖1 19批樣品紅外光譜圖(4 000～400 cm-1)Fig.1 Infrared spectra of nineteen batches of samples (4 000-400 cm-1)

表2顯示，3個(gè)品種的相似度為91.5%～99.5%，但在所含成分類(lèi)型或含量上仍存在差異；不同批次粉枝莓、紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子之間的相似度分別為92.2%～99.4%、97.6%～99.8%、95.6%～99.9%，表明產(chǎn)地和批次對(duì)藥材品質(zhì)有影響，以粉枝莓更明顯，與不同批次該藥材厚度質(zhì)地差異大的實(shí)際情況相符合。

表2 19批樣品紅外光譜圖相似度(%)

采用OMINIC 8.2軟件對(duì)同一品種不同批次樣品紅外光譜圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所得到的平均譜圖作為標(biāo)準(zhǔn)譜圖，見(jiàn)圖2，可知3個(gè)品種圖譜整體相似。其中，粉枝莓在775、3 794 cm-1處有穩(wěn)定的特征峰，紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子在1 601 cm-1處有穩(wěn)定的特征峰，黑腺美飾懸鉤子在1 614 cm-1處有穩(wěn)定的特征峰，可初步作為3個(gè)品種的鑒別依據(jù)。

注：A～C分別為粉枝莓、紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子。圖2 3個(gè)品種紅外光譜圖(4 000～400 cm-1)Fig.2 Infrared spectra of three species (4 000-400 cm-1)

3.2 紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜圖 將3個(gè)品種紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，得到紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜圖[19]，見(jiàn)圖3，可知三者整體吸收區(qū)域較為相似；相似度見(jiàn)表3，可知為66.39%～97.99%，而不同批次粉枝莓、紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子之間的相似度分別為69.2%～98.2%、95.5%～98.5%、89.4%～99.1%，均低于“3.1”項(xiàng)下結(jié)果，表明二階導(dǎo)數(shù)處理后數(shù)據(jù)靈敏度提高。其中，粉枝莓相似度差異最大，表明其品質(zhì)最不穩(wěn)定，受外界因素影響最大；紅泡刺藤相似度差異最小，體現(xiàn)了其品質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)。

圖3 19批樣品二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖(4 000～400 cm-1)Fig.3 Second derivative infrared spectra of nineteen batches of samples (4 000-400 cm-1)

表3 19批樣品紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜相似度(%)

3個(gè)品種在1 800～400 cm-1處的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖見(jiàn)圖4，可知三者峰形和峰強(qiáng)均有明顯差異，可用于鑒別。其中，區(qū)域1粉枝莓、黑腺美飾懸鉤子有3個(gè)向上的鋸齒，而紅泡刺藤有4個(gè)，可將前兩者和后者區(qū)分開(kāi)；區(qū)域10粉枝莓明顯有3個(gè)向上的鋸齒，而紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子不明顯；區(qū)域5、8中，粉枝莓、黑腺美飾懸鉤子峰形相似，但前者峰強(qiáng)更高。

圖4 3個(gè)品種二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖(1 800～400 cm-1)Fig.4 Second derivative infrared spectra of three species (1 800-400 cm-1)

3.3 聚類(lèi)分析 將19批樣品全波段譜圖進(jìn)行二階求導(dǎo)處理后，利用平方歐式距離和Ward系統(tǒng)聚類(lèi)法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析[20]，結(jié)果見(jiàn)圖5。由此可知，3個(gè)品種聚類(lèi)效果較差，19批樣品混雜無(wú)法分開(kāi)，其中粉枝莓最為分散，表明其品質(zhì)差異最大，與圖3～4一致；FZM-1和FZM-2、HP-2和HP-3為同一地點(diǎn)采集，但FZM-1和HP-2為老枝，F(xiàn)ZM-2和HP-3為嫩枝，并且圖中FZM-1和FZM-2、HP-2和HP-3差異很大；距離系數(shù)為7時(shí)，除了嫩枝HX-3外，其余黑腺美飾懸鉤子品種均聚為一類(lèi)，在一定程度上反映了生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)藥材品質(zhì)有很大影響，甚至超過(guò)品種本身的影響，同時(shí)也說(shuō)明3個(gè)品種所含成分的類(lèi)型或含量差異較小。

圖5 19批樣品聚類(lèi)分析圖Fig.5 Cluster analysis dendrogram for nineteen batches of samples

3.4 主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) 基于19批樣品的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖，建立PCA[21]、OPLS-DA[20,22]模型，見(jiàn)圖6～7。由圖6A可知，紅泡刺藤單獨(dú)聚為一類(lèi)，靠近黑腺美飾懸鉤子，表明兩者所含成分相似；粉枝莓、黑腺美飾懸鉤子出現(xiàn)混雜情況，交叉樣品為FZM-2、FZM-4、FZM-5，而FZM-1、FZM-6游離在外，與各批次其他2個(gè)品種的距離均較遠(yuǎn)，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。由圖6B可知，3個(gè)品種各自聚在一起，比二維聚類(lèi)效果好，但不同品種之間距離近，界限不清，難以進(jìn)行明確區(qū)分。由圖7可知，3個(gè)品種各自聚為一類(lèi)，界限明顯，但同一品種不同批次樣品之間的距離仍有一定差異，可能受到不同產(chǎn)地氣候、土壤或同一產(chǎn)地植株成熟程度等因素的影響，導(dǎo)致其品質(zhì)有所不同。

圖6 3個(gè)品種PCA二維得分(A)、三維得分圖(B)Fig.6 2D score plot (A) and 3D score plot (B) for PCA of three species

圖7 3個(gè)品種OPLS-DA二維得分(A)、三維得分(B)圖Fig.7 2D score plot (A) and 3D score plot (B) for OPLS-DA of three species

3.5 外部驗(yàn)證試驗(yàn) 取FZM-7、HP-5、HX-10、GJ、JH、HZ適量，按“3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果見(jiàn)圖8。由此可知，HP-5明顯與紅泡刺藤聚為一類(lèi)，F(xiàn)ZM-7明顯與粉枝莓聚為一類(lèi)，HX-10明顯與黑腺美飾懸鉤子聚為一類(lèi)，不屬于主流品種的GJ、JH、HZ游離在主流品種外面，表明OPLS-DA具有良好的鑒別能力。

4 討論

本研究采用傅里葉變換紅外光譜對(duì)藏藥懸鉤木3個(gè)主流品種進(jìn)行鑒別研究，發(fā)現(xiàn)19批樣品的紅外光譜圖整體相似，3個(gè)品種特征峰區(qū)別不明顯；經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)處理后，發(fā)現(xiàn)吸收區(qū)1 800～400 cm-1為3個(gè)品種的主要鑒別區(qū)域，其中粉枝莓和黑腺美飾懸鉤子的吸收差異較小。根據(jù)紅外光譜圖、二階導(dǎo)數(shù)光譜圖的相似度和聚類(lèi)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)紅泡刺藤品質(zhì)最為穩(wěn)定，不同產(chǎn)地粉枝莓受地域影響嚴(yán)重、品質(zhì)差異大；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，植物的生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)藥材品質(zhì)的影響最大，甚至超過(guò)產(chǎn)地和品種對(duì)藥材品質(zhì)的影響。在研究中采用的3種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法中，PCA和OPLS-DA能夠?qū)Ψ壑⒓t泡刺藤和黑腺美飾懸鉤子進(jìn)行區(qū)分，其中OPLS-DA的分類(lèi)結(jié)果最好。外部驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)ZM-7、HP-5和HX-10都正確地與相應(yīng)品種聚為一類(lèi)，證明建立的OPLS-DA鑒別方法對(duì)三個(gè)主流品種具有良好的鑒別能力。本研究為粉枝莓、紅泡刺藤和黑腺美飾懸鉤子的鑒別提供了快速、簡(jiǎn)便的方法，也為藏藥懸鉤木的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。