UPLC-MS/MS法測(cè)定止咳平喘中藥制劑中16種非法添加化學(xué)藥物

汪瑾彥， 梁 祈， 莊 玥， 蔡 霞

(廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510663)

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，哮喘已成為常見(jiàn)疾病之一[1]。一些不法分子為了達(dá)到速效目的，在止咳平喘中藥制劑中非法添加化學(xué)藥物，患者在不知情時(shí)服用了這些藥物，可能會(huì)對(duì)健康造成嚴(yán)重危害。

目前，我國(guó)止咳平喘類中藥中非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法2009031，涉及8種藥物(茶堿、磺胺甲噁唑、醋酸潑尼松、地西泮、馬來(lái)酸氯苯那敏、鹽酸苯海拉明、枸櫞酸噴托維林、磷酸苯并哌林)，采用HPLC法檢查和定量，LC-MS/MS法確證，并且均各采用2個(gè)色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。但該類添加通常為復(fù)合添加，故亟需提高檢驗(yàn)效率，擴(kuò)充檢驗(yàn)成分。

上述藥物大多采用HPLC法[2-5]、LC-MS/MS法[6-11]、薄層色譜法[12-14]等技術(shù)，通常以檢測(cè)8～18種為主[6-11]，一般檢出1～4種陽(yáng)性[6-10]，部分側(cè)重于定性篩查[9-10]。本研究選擇藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法2009031中的8種藥物，結(jié)合近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的其他8種作為研究對(duì)象，建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定上述16種非法添加物的檢測(cè)方法，以期為相關(guān)監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 LC-30 超高效液相色譜儀(日本島津公司)；SCIEX QTRAP5500三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(配ESI源)(美國(guó)Sciex公司)；KQ-300DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 茶堿、磺胺甲噁唑、醋酸潑尼松、地西泮、馬來(lái)酸氯苯那敏、鹽酸苯海拉明、枸櫞酸噴托維林、磷酸苯并哌林、對(duì)乙酰氨基酚、磷酸可待因、甲氧芐啶、鹽酸二氧丙嗪、氫溴酸右美沙芬、阿司匹林、雙氯芬酸鈉對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鹽酸異丙嗪對(duì)照品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈、甲酸(色譜純)；甲醇、甲酸銨(分析純)；0.22 μm針式濾膜過(guò)濾頭(津騰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取上述16種藥物對(duì)照品各10 mg，置于同一10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的貯備液，甲醇逐級(jí)稀釋成1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL系列溶液，即得。

2.2 樣品前處理

2.2.1 固體樣品 膠囊取內(nèi)容物，片劑、丸劑研磨成粉末后混勻，準(zhǔn)確稱取0.3 g至50 mL量瓶中，加適量甲醇超聲提取15 min，放冷至室溫，甲醇定容至刻度，搖勻，根據(jù)實(shí)際質(zhì)量濃度稀釋至線性范圍內(nèi)，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后待測(cè)。

2.2.2 液體制劑 搖勻后，準(zhǔn)確量取1.0 mL至50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲提取15 min，放至室溫，甲醇定容至刻度，搖勻，根據(jù)實(shí)際濃度稀釋至線性范圍內(nèi)，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后待測(cè)。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-10 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～0.5 min，5%A；0.5～9 min，5%A～70%A；9～10 min，70%A；10～11 min，70%A～95%A；11～13 min，95%A；13～13.1 min，95%A～5%A；13.1～16 min，5%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.3.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣35 psi(1 psi=6.895 kPa)；離子源溫度550 ℃；噴霧氣55 psi；輔助加熱氣55 psi；阿司匹林、雙氯芬酸為負(fù)離子模式掃描，離子化電壓-4 500 V；其他藥物為正離子模式掃描，離子化電壓5 500 V。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 16種藥物優(yōu)化質(zhì)譜條件

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.1.1 色譜柱選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)，結(jié)果前者分離效果較后者更優(yōu)，并且可滿足儀器分析要求。

3.1.2 流動(dòng)相選擇 止咳平喘類藥物通常以有機(jī)相(乙腈或甲醇)-緩沖鹽水溶液的混合溶劑體系作為流動(dòng)相，由于乙腈柱壓更小，而且質(zhì)譜響應(yīng)值更高，故選用乙腈作為有機(jī)相[15]。

本實(shí)驗(yàn)分別以乙腈-0.1%甲酸、乙腈-20 mmol/L乙酸銨、乙腈-10 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸)、乙腈-10 mmol/L乙酸銨(0.1%乙酸)為流動(dòng)相，結(jié)果乙腈-0.1%甲酸、乙腈-20 mmol/L乙酸銨洗脫時(shí)，部分目標(biāo)物保留時(shí)間接近，峰型較差；乙腈-10 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸)、乙腈-10 mmol/L乙酸銨(0.1%乙酸)洗脫時(shí)，目標(biāo)物響應(yīng)值較高，峰型較好，大部分藥物能較好地分離?？紤]10 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸)體系中地西泮與雙氯芬酸分離度優(yōu)于10 mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)體系中，因此，選擇乙腈-10 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸)作為流動(dòng)相。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用直接進(jìn)樣的方式，分別將16種藥物對(duì)照品溶液注入質(zhì)譜的離子源中，優(yōu)化質(zhì)譜條件，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行Q1全掃描，選擇合適的電離方式和準(zhǔn)分子離子。再對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行MS2全掃描，以1～2個(gè)相對(duì)豐度最高的子離子作為定性離子，其中相對(duì)豐度較高的離子作為定量離子，然后，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下優(yōu)化各子離子的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)，MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

1.對(duì)乙酰氨基酚 2.茶堿 3.可待因 4.甲氧芐啶 5.鹽酸二氧丙嗪 6.磺胺甲噁唑 7.馬來(lái)酸氯苯那敏8.氫溴酸右美沙芬 9.鹽酸苯海拉明 10.鹽酸異丙嗪 11.枸櫞酸噴托維林 12.醋酸潑尼松 13.磷酸苯丙哌林14.地西泮 15.阿司匹林 16.雙氯芬酸鈉1.paracetamol 2.theophylline 3.codeine 4.trimethoprim 5.dioxopromethazine hydrochloride 6.sulfamethoxazole 7.chlorpheniramine maleate 8.dextromethorphan hydrobromide 9.diphenhydramine hydrochloride 10. promethazine hydrochloride 11.pentoxyverine citrate 12.prednisone acetate 13.benproperine phosphate 14.diazepan 15.aspirin 16.diclofenac sodiom圖1 各藥物MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various drugs

3.3 提取溶劑選擇 止咳平喘類藥物一般以甲醇為溶劑[2-10]，這可能是由于它們具有較好的脂溶性。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇對(duì)16種藥物的提取效果，發(fā)現(xiàn)溶解性均較好，回收率達(dá)到檢測(cè)要求，綜合考慮成本、試劑毒性等因素，最終以其為提取溶劑。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 專屬性試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)選擇陽(yáng)性檢出率較高的膠囊劑和口服液2種基質(zhì)，分別作為固態(tài)和液態(tài)止咳平喘中藥制劑的代表基質(zhì)。取膠囊和口服液陰性樣品若干批，按“1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理后進(jìn)樣分析，結(jié)果均未檢出。

3.4.2 線性關(guān)系考察 本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件下，對(duì)系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，以MRM定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，表明各藥物在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再以定量離子對(duì)的信噪比S/N≥3作為L(zhǎng)OD，≥10作為L(zhǎng)OQ，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)取上述2種基質(zhì)的陰性樣品，加入對(duì)照品適量，制成3個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)水平6份，按“1.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取10 μg/L對(duì)照品溶液，于 0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得各成分峰面積RSD為2.4%～11.0%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 陽(yáng)性樣品檢測(cè) 從互聯(lián)網(wǎng)和實(shí)體經(jīng)營(yíng)場(chǎng)所收集42批樣品，按上述方法檢測(cè)，檢出陽(yáng)性樣品13批(膠囊7批、粉劑3批、丸劑1批、液體制劑2批)，檢出率31.0%，其中有10批來(lái)自網(wǎng)購(gòu)，表明網(wǎng)絡(luò)銷售產(chǎn)品具有較大風(fēng)險(xiǎn)；共檢出12種藥物，其中茶堿、醋酸潑尼松、馬來(lái)酸氯苯那敏是最為常見(jiàn)的非法添加；較補(bǔ)充檢驗(yàn)方法2009031新增的8種藥物均檢出陽(yáng)性樣品，其中右美沙芬、異丙嗪為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。具體見(jiàn)表4。

表2 各藥物線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various drugs

表3 各藥物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

不合格樣品中，普遍存在多種藥物復(fù)合添加的情況，而且含量差異巨大，最常見(jiàn)的方式為“茶堿+醋酸潑尼松+其他”，這種聯(lián)合用藥的隨意性可能對(duì)患者健康造成嚴(yán)重的損害。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定止咳平喘類中藥制劑中16種非法添加化學(xué)藥物，擴(kuò)充了現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)藥物，結(jié)果均檢出陽(yáng)性樣品，并且首次報(bào)道了氫溴酸右美沙芬和鹽酸異丙嗪，該方法實(shí)用性強(qiáng)，可為相關(guān)監(jiān)督檢驗(yàn)提供有力的技術(shù)支撐。

表4 陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果