半夏瀉心湯含藥血清對胃癌細胞來源外泌體誘導(dǎo)BMSCs增殖、遷移、侵襲的影響

董俊剛， 劉喜平*， 李沛清， 王慶苗， 朱中博， 崔國寧

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

胃癌目前居腫瘤性死亡病因的第2位[1]，其發(fā)生發(fā)展與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)有關(guān)[2]。在胃癌前病變期BMSCs可歸巢至胃黏膜部，參與胃黏膜修復(fù)，與胃上皮細胞融合轉(zhuǎn)化為胃癌細胞[3]；胃癌發(fā)生后，BMSCs可歸巢至腫瘤部位，成為腫瘤微環(huán)境的重要細胞成分[4]，能促進腫瘤的生長進展[5]。課題組前期研究表明，BMSCs在胃癌微環(huán)境中可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，從而具有體內(nèi)致瘤特性[5-6]。

外泌體(exosome，Exo)是微環(huán)境細胞間生物信息物質(zhì)傳遞的生物活性囊泡，它富集、包裹了在細胞外液中易失活或降解的成分，可靶向受體細胞并被攝取，激活胞內(nèi)相關(guān)信號通路，調(diào)控受體細胞生物學(xué)特性。研究顯示，胃癌微環(huán)境中的胃癌細胞能通過分泌的外泌體誘導(dǎo)BMSCs促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移[7]。音猬因子(sonic hedgehog，Shh)信號通路是調(diào)控BMSCs增殖分化的關(guān)鍵信號通路[8]，但胃癌來源外泌體能否靶向BMSCs，調(diào)控BMSCs胞內(nèi)Shh信號通路，誘導(dǎo)BMSCs生物學(xué)特性的惡性轉(zhuǎn)化，以及上述過程能否被干預(yù)目前并不清楚。

胃癌屬中醫(yī)“伏梁”“反胃”“積聚”等范疇，其病機與寒熱錯雜、正虛痰結(jié)有關(guān)[9]。半夏瀉心湯源自《傷寒論》，功效平調(diào)寒熱、健脾散結(jié)，是治療胃癌的有效方劑[10]。課題組前期研究表明，半夏瀉心湯對荷胃癌裸鼠有明顯的抑瘤作用[11]，也可抑制人胃癌BGC-823細胞生長增殖[12-13]，同時對胃癌微環(huán)境中BMSCs的惡變促瘤有明顯的抑制作用[14]。本研究在觀察半夏瀉心湯干預(yù)BMSCs攝取胃癌來源外泌體的基礎(chǔ)上，探討該方通過調(diào)控Shh信號通路對胃癌來源外泌體誘導(dǎo)BMSCs增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)特性的影響，從腫瘤外泌體途徑闡釋BMSCs的惡變促瘤機制，為胃癌臨床治療及相關(guān)藥物新作用靶點開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞與動物 人胃癌NCI-N87細胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；大鼠BMSCs(細胞密度2×105/mL)，由重慶威斯騰生物科技公司分離提供。8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2020-0001，動物使用許可證號SYXK(甘)2020-0009，飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、相對濕度(50 ±10)%的SPF級實驗室。研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(倫理審查號2018-009)。

1.2 試劑與藥物 半夏瀉心湯組方藥材飲片(半夏、干姜、黃芩、黃連、人參、大棗、甘草)均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院景明教授鑒定符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。胎牛血清、無外泌體血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司，貨號分別為HLC0101、10828-028、11995-065)；微量BCA蛋白定量試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號BC201)；Exo-Quick-TC(美國SBI公司，貨號EXOTC50A-1)；MTT試劑盒、兔來源一抗CD63、兔來源一抗CD9、二抗羊抗兔IgG、二抗羊抗鼠IgG、β-actin(英國Abcam公司，貨號分別為20140165、ab92726、ab92643、ab6728、ab150077、ab8226)；Matrigel基質(zhì)膠(美國Corning公司，貨號356234)；兔一抗Gli1(美國Thermo Fisher公司，貨號MA5-32553)；兔一抗Ptch1(藥明康德，貨號AP51457)；兔一抗c-Myc(美國CST公司，貨號9402)；小鼠一抗Shh(美國Santa Cruz公司，貨號sc-373779)；兔一抗Smo(成都正能生物技術(shù)有限公司，貨號503274)；結(jié)晶紫、1,1′-雙十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，Dil)(美國Sigma公司，貨號分別為C6158、41085-99-8)；DAPI染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號C1005)；Shh阻斷劑GANT61(美國MCE公司，貨號HY-13901)。

1.3 儀器 透射電子顯微鏡7500(日本Hitachi公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)；8 μm Transwell小室(美國Corning公司)；細胞計數(shù)板(上海醫(yī)用儀器廠)。

2 方法

2.1 含藥血清制備及大鼠分組、給藥 按原方劑量(半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，大棗4枚，甘草9 g)稱取組方藥材飲片[15]，混合后浸泡30 min，煎煮2次，第1次加8倍量水煎煮1.5 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并煎液，離心過濾，濾液分別減壓濃縮至生藥量2.7、1.35、0.675 g/mL。按照人與動物體表面積折算的等效劑量(中劑量為臨床等劑量，低、高劑量組分別是中劑量的0.5、2倍)，半夏瀉心湯低、中、高劑量組劑量分別為54、27、13.5 g/kg。

參考文獻[16]報道的方法，32只大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機數(shù)字表法分為空白組及半夏瀉心湯低、中、高劑量組，每組8只，實驗前禁食不禁水12～24 h，半夏瀉心湯低、中、高劑量組大鼠每次分別灌胃給予2.7、1.35、0.675 g/mL的半夏瀉心湯，每天2次，每次2 mL，空白組灌胃給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。末次給藥后1 h麻醉大鼠，腹腔解剖，腹主動脈采集全血，靜置分層后3 000 r/min離心10 min，收集血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 NCI-N87外泌體分離和純化 收集正常培養(yǎng)的NCI-N87細胞，PBS洗2～3次，更換為無外泌體血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，0.22 μm濾膜過濾去除較大的囊泡，將外泌體上清與Exo Quick-TC試劑以5∶1的比例混合，反復(fù)顛倒3次，4 ℃孵育過夜，10 000 r/min離心30 min，棄去上清液，沉淀用0.5 mL PBS重懸，獲得提取物懸液，按微量BCA蛋白定量試劑盒說明書對提純后的NCI-N87-Exo進行定量，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.3 NCI-N87外泌體鑒定 取分離純化NCI-N87-Exo溶液20 μL，均勻后滴加于直徑2 mm的載樣銅網(wǎng)上，在干燥環(huán)境中讓Formvar膜吸收20 min，將100 μL PBS加到封口膜上，用鑷子將銅網(wǎng)放在PBS液滴上清洗。50 μL 2.5%戊二醛滴于銅網(wǎng)上，室溫下復(fù)染5 min，反差增強及包埋樣本后，置于透射電鏡下(80 kV)觀察拍攝并保存。將NCI-N87外泌體用細胞裂解液處理后，4 ℃離心5 min，取上清液，BCA法檢測濃度，Western blot法檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63及鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)表達，加入6×蛋白樣品上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min變性。以20 μg總蛋白量進行點樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、洗滌封閉，結(jié)合一抗 (CD9、CD63、calreticulin，稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)4 ℃過夜，洗滌，室溫結(jié)合二抗 (山羊抗兔IgG按1∶1 000稀釋) 孵育2 h，洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光液顯影法檢測蛋白條帶，Image J軟件分析灰度值。

2.4 細胞分組及共培養(yǎng)體系建立 將分離純化后質(zhì)量濃度為100 μg/mL的NCI-N87外泌體與熒光活性染料Dil按1 000∶1的比例混合，避光放置30 min，4 ℃、100 000 r/min離心90 min，PBS重懸后再次超速離心，棄上清，獲得Dil標記的NCI-N87外泌體。實驗分為空白組，模型組，半夏瀉心湯低、中、高劑量組及Shh阻斷劑組，各組上室加入2×105/mL BMSCs懸液1.5 mL(DMEM培養(yǎng)基+100 μg/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)，下室均加入無外泌體血清的培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液中+10%無外泌體血清+100 μg/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)。除空白組外，其他各組下室加入含1 mL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的NCI-N87外泌體，半夏瀉心湯高、中、低劑量組上室內(nèi)各加入10%的半夏瀉心湯含藥血清，模型組及空白組上室加入10%的空白血清，Shh阻斷劑組上室加入含20 μmol/L GANT61的10%空白血清。48 h后終止培養(yǎng)，收集細胞，倒置相差顯微鏡下觀察各組BMSCs的形態(tài)變化，并進行其他相關(guān)檢查。

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察BMSCs對NCI-N87外泌體的攝取 收集各組BMSCs，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸取培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定，PBS清洗細胞，常溫細胞爬片15 min，PBS洗滌3次，每次10 min，滴加含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(4′，6-diamino-2-pheny-lindole，DAPI)的染液，避光孵育15 min，對細胞核進行復(fù)染，PBS洗4次，每次5 min，用含抗熒光淬滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組BMSCs內(nèi)紅色熒光表達，并用Image J pro plus 6.0軟件分析各組BMSCs紅色熒光標記的MOD。

2.6 MTT法檢測BMSCs增殖率 將MTT溶于PBS，配成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。收集各組BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單細胞懸液，細胞培養(yǎng)液調(diào)整其密度為1×105/mL，取100 μL接種于96孔板中，每組細胞設(shè)3個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d后，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去多余MTT和培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長處測定吸光度A，計算細胞增殖率，公式為細胞增殖率=[(A實驗組-A空白孔)/(A空白組-A空白孔)]×100%。

2.7 Transwell檢測BMSCs侵襲及遷移 4 ℃下將Matrigel基質(zhì)膠與預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋，取50 μL均勻鋪于Transwell小室上室，在37 ℃培養(yǎng)箱中過夜凝固，每組設(shè)3個平行孔，上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的密度為2×105/mL的BMSCs細胞懸液150 μL，下室24孔板加入600 μL無外泌體血清培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出Transwell小室，吸棄培養(yǎng)基，棉簽擦去上室殘留細胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在100倍視野下觀察拍照，顯微鏡下隨機5個視野，計數(shù)并評價細胞侵襲能力。遷移實驗在Transwell小室腔膜上不鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟同侵襲實驗。

2.8 Western blot檢測BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達 收集各組BMSCs，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，100 ℃變性10 min，得到蛋白樣品，80 V電泳跑過濃縮膠后電壓轉(zhuǎn)為120 V，將電流調(diào)整至恒流200 mA后轉(zhuǎn)移2 h，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，封閉液將一抗(Shh、Ptch1、Smo、c-Myc、Gli1)按1∶500稀釋，內(nèi)參一抗β-actin按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，用封閉液將二抗按1∶1 000稀釋，室溫孵育1.5 h，TBST洗4次。將ECL曝光液覆蓋在整片膜上反應(yīng)2 min，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)軟件測灰度值，計算蛋白相對表達。

3 結(jié)果

3.1 NCI-N87外泌體鑒定 由圖1可見，NCI-N87外泌體有完整的雙層包膜，形成呈橢圓或碟狀的囊泡結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低密度物質(zhì)，粒徑介于40～80 nm之間(黃色箭頭)。外泌體特征性相關(guān)蛋白表達分別為CD9的86.47±3.25、CD63的93.82±5.95，高于胃癌細胞的49.15±6.53、77.00±2.56(P<0.05)；鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)未見明顯表達，但在NCI-N87細胞中有明顯表達，提示獲得了NCI-N87外泌體，符合后續(xù)實驗要求。

圖1 NCI-N87外泌體的鑒定Fig.1 Identification of exosomes in NCI-N87 cells

3.2 BMSCs對NCI-N87外泌體的攝取 由圖2可見，與空白組比較，模型組BMSCs內(nèi)可見大量紅色熒光標記，MOD值(25.16±2.38)升高(P<0.05)；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組BMSCs內(nèi)紅色熒光標記減弱，MOD值分別為16.34±3.29、18.97±2.13、24.89±1.25，以高劑量組更明顯(P<0.05)；Shh阻斷劑組BMSCs內(nèi)紅色熒光標記減弱，MOD值(9.22±0.76)降低(P<0.05)。

圖2 各組BMSCs對NCI-N87外泌體的攝取(DAPI染色，×400)Fig.2 Uptakes of NCI-N87 cells exosomes by BMSCs in various groups(DAPI staining，×400)

3.3 BMSCs形態(tài)變化 由圖3可見，空白組BMSCs呈短平長梭形，有序均勻排列，似成纖維細胞樣生長，有明顯的折光性；模型組BMSCs呈集落樣團狀生長，細胞排列紊亂，細胞間連接疏松，與人胃癌NCI-N87細胞形態(tài)有相似之處；經(jīng)半夏瀉心湯低、中、高劑量含藥血清干預(yù)后大部分細胞呈梭形，偶見團狀生長，但凋亡細胞增多。

3.4 BMSCs增殖率 由表1可見，從第3天開始，模型組相同時間點BMSCs增殖率高于空白組(P<0.05)；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組BMSCs的增殖率均降低(P<0.05)，以高劑量組在4、5、6、7 d更明顯(P<0.05)。

圖3 各組BMSCs形態(tài)變化(×100)Fig.3 Morphological changes of BMSCs in various groups (×100)

表1 各組BMSCs增殖率

3.5 BMSCs侵襲及遷移 由圖4～5、表2可見，模型組BMSCs穿過Transwell小室濾過膜的細胞數(shù)量高于空白組(P<0.05)；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組BMSCs穿過Transwell小室濾過膜的細胞數(shù)量減少(P<0.05)，以高劑量組更明顯(P<0.05)。

圖4 各組BMSCs遷移能力(×100)Fig.4 Migration ability of BMSCs in various groups (×100)

圖5 各組BMSCs侵襲能力(×100)Fig.5 Invasion ability of BMSCs in various groups (×100)

3.6 BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc的蛋白表達 由表3、圖6可見，與空白組比較，模型組BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達降低(P<0.05)，以高劑量組更明顯(P<0.05)。

表2 各組BMSCs穿膜細胞數(shù)

4 討論

BMSCs被認為是胃癌細胞的起源之一[17]，在前期階段能夠靶向遷移至胃黏膜的受損位置，參與損傷修復(fù)，而在后期階段其失控性增殖產(chǎn)生癌腫[18]。臨床胃癌組織及裸鼠體內(nèi)致瘤組織分離得到胃癌細胞時，其生物學(xué)特性與BMSCs相似[19]。進一步研究顯示，處于胃癌微環(huán)境中的BMSCs，其基因表達、分化能力、擴增潛能和免疫表型等生物學(xué)特性已發(fā)生改變來適應(yīng)腫瘤微環(huán)境[20]。

表3 各組BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達

注：A為空白組，B為模型組，C為半夏瀉心湯低劑量組，D為半夏瀉心湯中劑量組，E為半夏瀉心湯高劑量組，F(xiàn)為Shh阻斷劑組。圖6 各組BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達Fig.6 Protein expressions of Shh, Ptch1, Smo, Gli1 and c-Myc of BMSCs in various groups

腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞、基質(zhì)細胞(間充質(zhì)干細胞、成纖維細胞等)、細胞外基質(zhì)及生長因子、細胞因子、其他小分子等共同構(gòu)成的一個復(fù)雜的動態(tài)環(huán)境系統(tǒng)[21]。研究表明，腫瘤微環(huán)境中非腫瘤細胞在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[22]，BMSCs是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境重要的非腫瘤細胞成分之一[23]。腫瘤外泌體參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)控，其富集、包裹了多種生物信息物質(zhì)，被腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細胞攝取后能夠激活胞內(nèi)信號通路對受體細胞進行多途徑、多位點的精細調(diào)節(jié)，在促進非腫瘤細胞增殖惡化方面具有重要作用[24]。

c-Myc是Shh信號通路核轉(zhuǎn)錄因子蛋白Gli的下游8號染色體癌基因[25]，為癌癥相關(guān)細胞過度增殖更明顯的標志之一[26]，在激活端粒酶活性、促進BMSCs惡性轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要作用[27]。Shh通路由分泌型信號糖蛋白Sonic hedgehog配體(Shh)、12次跨膜受體蛋白Patched1(Ptch1)、G蛋白偶聯(lián)受體樣蛋白Smoothened(Smo)及下游核轉(zhuǎn)錄因子蛋白Gli(Gli1、Gli2、Gli3，主要為Gli1)組成，Shh與Ptch1結(jié)合使Ptch1與Smo脫離，Smo活化后激活Gli，Gli進入細胞核調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[28]。通過激活Shh信號通路下游的關(guān)鍵分子Gli1，可促進BMSCs生長增殖與分化[29]。

本研究結(jié)果表明，NCI-N87外泌體能夠被正常BMSCs攝取，BMSCs細胞形態(tài)發(fā)生變化，增殖、遷移能力明顯增強，有惡性轉(zhuǎn)化的趨勢。半夏瀉心湯含藥血清能夠抑制BMSCs對NCI-N87外泌體的攝取，經(jīng)半夏瀉心湯干預(yù)后，BMSCs呈梭型生長，凋亡增多，增殖及侵襲能力均降低，同時發(fā)現(xiàn)BMSCs細胞內(nèi)Shh信號通路相關(guān)蛋白Shh、Ptch1、Smo、Gli1及c-Myc表達下降，表明半夏瀉心湯含藥血清阻抑胃癌細胞來源外泌體誘發(fā)的BMSCs惡性轉(zhuǎn)化，其機制與抑制Shh信號通路與下游信號分子c-Myc蛋白的表達有關(guān)。