柴銀顆粒揮發(fā)油膠體磨包合工藝的優(yōu)化

高艷紅， 孫孝華， 武光云， 沈慶國， 關(guān)永霞*， 張貴民

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；2.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006)

柴銀顆粒是由山東魯南制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的中藥復(fù)方制劑，來源于古方柴葛解肌湯和銀翹散，由柴胡、金銀花、黃芩等11味中藥組成，具有清熱解毒，止咳、利咽等功效，主治上呼吸道感染外感風(fēng)熱證，對治療風(fēng)熱感冒引起的發(fā)熱、咽喉腫痛、鼻塞等療效確切[1-3]。方中柴胡、連翹、荊芥、薄荷等多味藥材含有揮發(fā)油，具有發(fā)汗解熱、抗炎、抗病毒多種藥理作用[3-4]，但有些氣味濃烈，若在制劑過程中直接加入不僅異味較大，而且易吸附于包裝袋上，難以保障揮發(fā)油在成品中的均一性。研究表明，揮發(fā)油經(jīng)環(huán)糊精包合后能提高其穩(wěn)定性，掩蓋不良?xì)馕叮档痛碳ば?，同時還可實現(xiàn)液體藥物粉末化，更加便于制劑，從而大大拓寬其應(yīng)用范圍[5-7]。

目前，常用的揮發(fā)油包合方法有飽和水溶液法、研磨法、超聲法等[8-9]，目前采用飽和水溶液包合法生產(chǎn)柴銀顆粒，但其操作繁瑣，生產(chǎn)周期長，不利于產(chǎn)業(yè)化。膠體磨研磨法具有包合溫度低、揮發(fā)油利用率高、包合時間短、可連續(xù)化生產(chǎn)、適合工業(yè)化等特點[10]，故本實驗采用該方法包合柴銀顆粒揮發(fā)油，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化該工藝，以期為該制劑大規(guī)模開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

GC-2030型高效氣相色譜儀(日本島津公司)；MS1003TS/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。β-環(huán)糊精(孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司)；薄荷腦(批號110728-201707，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈為色譜純(美國天地有限公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取 按照柴銀顆粒制法，按處方比例稱取柴胡、連翹、荊芥、薄荷等含油藥材飲片，投入多功能提取罐中，加入適量水，采用水蒸氣蒸餾法提取，收集揮發(fā)油，置于冷庫中貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 空白回收率測定 按2020年版《中國藥典》四部通則“2204揮發(fā)油測定法”[11]測定空白回收率，平行3次，公式為空白回收率=(揮發(fā)油收集量/揮發(fā)油投入量)×100%，測得其數(shù)值為93.75%。

2.3 評價指標(biāo)確定 揮發(fā)油包合一般以包封率為指標(biāo)，但在實際生產(chǎn)過程中包合物得率更直觀，也易于測定，故以包封率(Y1)、包合物得率(Y2)的綜合評分(Y)為評價指標(biāo)，通過SPSS 22.0軟件中的熵值法進(jìn)行計算，設(shè)定兩者權(quán)重系數(shù)分別為78.94%、21.06%，計算公式為包封率=[包合物中揮發(fā)油量/(投油量×揮發(fā)油空白回收率)]×100%、包合物收率=[包合物質(zhì)量/(β-環(huán)糊精加入量+揮發(fā)油加入量)]×100%、綜合評分=(包封率×78.94%+包合物得率×21.06%)×100。

2.4 單因素試驗

2.4.1 揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例 固定β-環(huán)糊精與水比例為1∶3，包合時間為25 min，揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，結(jié)果見圖1。由此可知，隨著兩者比例增加，綜合評分先升高，在1∶10時達(dá)到最大值，之后略有降低，故選擇1∶8～1∶12進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例對綜合評分的影響Fig.1 Effect of volatile oil-(β-cyclodextrin) ratio on comprehensive score

2.4.2 β-環(huán)糊精與水比例 固定揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例為1∶10，包合時間為25 min，β-環(huán)糊精與水比例為1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶6，結(jié)果見圖2。由此可知，隨著用水量增加，綜合評分先迅速升高，在兩者比例為1∶3時達(dá)到最大值，之后明顯降低，故選擇1∶2～1∶4進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 β-環(huán)糊精與水比例對綜合評分的影響Fig.2 Effect of (β-cyclodextrin)-water ratio on comprehensive score

2.4.3 包合時間 固定揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例為1∶10，β-環(huán)糊精與水比例為1∶3，包合時間為10、15、20、25、30 min，結(jié)果見圖3。由此可知，隨著包合時間延長，綜合評分先迅速升高，在25 min時達(dá)到最大值，在30 min后略有降低并趨于穩(wěn)定，故選擇20～30 min進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖3 包合時間對綜合評分的影響Fig.3 Effect of inclusion time on comprehensive score

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法 以揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例(A)、β-環(huán)糊精與水比例(B)、包合時間(C)為影響因素，綜合評分(Y)為評價指標(biāo)，Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化包合工藝，結(jié)果見表1，方差分析見表2。由此可知，模型P<0.01，達(dá)到極顯著水平；失擬項P>0.01，無顯著影響。

再對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得方程為Y=86.78+2.73A+2.52B+2.26C-3.23AB-0.48AC-0.71BC-10.82A2-9.71B2-6.65C2，R2=0.951 6>0.9，表明模型擬合度較好；A、A2、B2、C2達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，B、C、AB達(dá)到顯著水平(P<0.05)，響應(yīng)面分析見圖4。

表1 試驗設(shè)計與結(jié)果

表2 方差分析

注：左圖為三維曲面圖，右圖為等高線圖。圖4 各因素響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for various factors

2.6 驗證試驗 通過Design-Expert v10.0.7軟件，得最優(yōu)工藝為揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例1∶10.29，β-環(huán)糊精與水比例1∶3.10，包合時間25.95 min，綜合評分為86.16分，為了方便車間生產(chǎn)實際操作，將其修正為揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例1∶10，β-環(huán)糊精與水比例1∶3，包合時間26 min。在上述優(yōu)化工藝下進(jìn)行3批驗證試驗，測得平均包封率為84.03%，包合物得率為90.67%，綜合評分為85.43分，RSD為1.14%，與預(yù)測值86.16分接近，表明該工藝具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.7 包合效果評價 包合物用3倍量石油醚洗滌3次，晾干，精密稱取適量至量瓶中，加適量無水乙醇，超聲處理30 min脫包，定容至刻度，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣測定，再以乙醇溶解未包合揮發(fā)油為對照，結(jié)果見圖5。由此可知，包合前后圖譜高度相似，即各成分基本無變化，表明包合效果良好。

注：A為揮發(fā)油，B為包合物。圖5 各樣品HPGC色譜圖Fig.5 HPGC chromatograms of various samples

3 討論

柴銀顆粒臨床上主要用于治療風(fēng)熱感冒[12]，含有柴胡、連翹、荊芥、薄荷等解表類中藥，功效發(fā)汗解表、宣散風(fēng)熱。由于揮發(fā)油揮發(fā)性較強(qiáng)，在制備或放置過程中其含量容易降低甚至消失，導(dǎo)致影響產(chǎn)品質(zhì)量，故采用環(huán)糊精包合技術(shù)進(jìn)行包合，可形成“分子膠囊”，避免它直接與外界環(huán)境接觸，從而提高了穩(wěn)定性[13-14]。

在柴銀顆粒生產(chǎn)過程中，采用飽和水溶液法包合揮發(fā)油，但由于其用量較大，緩慢滴加所需時間較長，并且需要全程保溫，能耗較大，而膠體磨包合具有時間短、包合效果好、操作簡便等優(yōu)點[15-16]。高效氣相色譜(HPGC)法能直觀反映包合前后揮發(fā)油變化情況，但不能對該成分包合效果進(jìn)行評價；包封率、包合物得率為衡量包合效果的主要指標(biāo)，能更真實準(zhǔn)確地反映其包合情況。因此，本實驗以包封率、包合物得率為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化柴銀顆粒揮發(fā)油膠體磨包合工藝，再通過HPGC法進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)所得最優(yōu)工藝穩(wěn)定可行，包合物包合效果理想，揮發(fā)油成分被很好地保留下來，可為后續(xù)相關(guān)制劑開發(fā)及臨床療效研究奠定基礎(chǔ)。