馬蹄黃總黃酮、總酚酸提取工藝優(yōu)化及其抗氧化、抗菌活性研究

關(guān)奎奎， 汪 露， 李聰聰， 陳朝喜

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

馬蹄黃SpenceriaramalanaTrimen為藏區(qū)民間常用藥材，藏文名“鄔堅德爾佳”，系薔薇科馬蹄黃屬多年生草本植物，主要分布于西藏、云南、四川海拔2 950～5 000 m的山坡草地、林間草地、山坡灌叢中[1]，其味甘、苦，性寒，具有通便解毒、收斂止瀉、平衡察隆等功效，泡水代茶飲可用于治療腹脹、痢疾、高血壓等癥，水煎膏劑亦可防皸裂[1-2]，所含總黃酮具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、止血活性[3]。Lee等[4]發(fā)現(xiàn)，馬蹄黃80%乙醇提取物能顯著抑制糖尿病相關(guān)的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)形成，并從中分離出6種能夠有效緩解高糖誘導(dǎo)斑馬魚視網(wǎng)膜透明血管擴(kuò)張的原花青素；相關(guān)研究也表明，馬蹄黃甲醇浸提物對多重耐藥、具有強(qiáng)成膜能力的大腸桿菌具有良好的抑菌活性[5]。

大量研究表明，植物中的黃酮、酚酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒、保護(hù)肝臟、保護(hù)心血管等多種生物活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、動物保健等行業(yè)[6-13]。因此，本實驗采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化馬蹄黃總黃酮、總酚酸提取工藝，并評價其抗氧化、抗菌活性，以期為該植物開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 馬蹄黃全草于2019年10月采自四川省甘孜州色達(dá)縣丹青藥王神山(北緯32°11′27″，東經(jīng)100°25′48″，海拔3 900 m)，經(jīng)西南民族大學(xué)獸醫(yī)藥理實驗室陳朝喜副教授鑒定為薔薇科馬蹄黃屬植物馬蹄黃SpenceriaramalanaTrimen新鮮全草。沒食子酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度≥92.5%)。福林酚試劑(1 mol/L)、1.1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，純度≥98%)(上海源葉生物科技有限公司)；L-抗壞血酸(上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，純度≥99%)。其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 菌種 大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC43300)保存于西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)實驗室。

1.3 儀器 KQ-5200DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；ZN-500A高速中藥粉碎機(jī)(長沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠)；4-20R醫(yī)用離心機(jī)(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技有限公司)；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；GR85DA高壓滅菌器[致微(廈門)儀器有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物制備 將藥材全草風(fēng)干、粉碎后過篩，精密稱取不同粉碎程度的粉末適量，加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇，在適宜溫度水浴下超聲提取一段時間，離心取上清，減壓濃縮后冷凍干燥，即得。

2.2 總黃酮、酚酸提取率測定

2.2.1 沒食子酸線性關(guān)系考察 采用Folin-Ciocalteu法[14]。精密稱取2.040 mg沒食子酸對照品，超純水溶解定容至10 mL量瓶中，得到0.20 mg/mL對照品溶液，依次稀釋至10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL，分別精密量取50 μL，加入200 μL超純水、250 μL福林酚(每1 mL加8 mL水稀釋)，室溫避光靜置5 min，加入250 μL 10%碳酸鈉，30 ℃恒溫避光1 h，采用酶標(biāo)儀在765 nm波長處測定吸光度，平行3次。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.003 6X+0.050 4(R2=0.999 4)，在10.00～80.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 蘆丁線性關(guān)系考察 精密稱取2.155 mg蘆丁對照品，無水乙醇溶解并定容于10 mL量瓶中，得到0.20 mg/mL對照品溶液，分別精密移取25、50、75、100、125、150、175、200 μL，補(bǔ)充無水乙醇至總體積為600 μL，加入5%亞硝酸鈉溶液50 μL，振蕩混勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液50 μL，振蕩混勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液300 μL，振蕩混勻后靜置15 min，采用酶標(biāo)儀在508 nm波長處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.001 8X+0.039 2(R2=0.999 7)，在8.33～66.67 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好

2.3 單因素試驗 分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、70%、90%)、提取時間(10、30、50、70、90 min)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)、粉碎程度(20、40、60、80、100目)對總黃酮、總酚酸提取率的影響。結(jié)果，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，兩者提取率先升后降，在50%時最高；總黃酮提取率隨著提取時間延長而升高，50 min后基本趨于穩(wěn)定，而總酚酸提取率在50 min后呈下降趨勢；液料比較低時，溶出物質(zhì)量濃度較高而出現(xiàn)飽和，從而抑制兩者溶出，而液料比較高時，有限量藥材不足以使溶液發(fā)揮最大溶出效率，在40∶1時最高；總黃酮提取率在40 ℃下最高，而總酚酸在50 ℃下才達(dá)到最大值，但隨著提取溫度進(jìn)一步增加，兩者提取率均降低，可能是由于高溫會導(dǎo)致其分解或使得其他雜質(zhì)溶出所致；粉碎程度為20目時，總酚酸提取率顯著低于40目以上時，但總黃酮提取率在粉碎程度80、100目時反而降低，可能與其他優(yōu)先溶出雜質(zhì)產(chǎn)生的抑制作用有關(guān)。

2.4 提取工藝優(yōu)化

2.4.1 Plackett-Burman設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以總黃酮、總酚酸提取率為響應(yīng)值，采用Minitab 16軟件進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計[15]，共12組，每組重復(fù)3次，結(jié)果見表1，方差分析見表2。由此可知，模型P均<0.01，R2、AdjR2、PredR2均在可接受范圍內(nèi)，表明它能準(zhǔn)確預(yù)測影響因素顯著性；X2(提取時間)、X3(提取溫度)、X5(粉碎程度)均有顯著影響(P<0.05，P<0.01)；各因素影響程度依次為X3(提取溫度)>X5(粉碎程度)>X2(提取時間)>X4(液料比)>X1(乙醇體積分?jǐn)?shù))。

表1 Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果

表2 Plackett-Burman設(shè)計方差分析

2.4.2 Box-Behnken響應(yīng)面法 依據(jù)單因素試驗、Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比為40∶1，以提取時間(A)、提取溫度(B)、粉碎程度(C)為影響因素，總黃酮(Y1)、總酚酸(Y1)提取率為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計與結(jié)果

通過Design expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得回歸方程分別為Y1=10.66+0.85A+1.09B+0.63C-0.82AB-0.47AC-0.38BC-0.87A2-1.05B2+1.00C2、Y2=29.57+2.05A+2.45B+1.44C-1.49AB-0.027AC-1.09BC-4.23A2-2.47B2+3.09C2，方差分析見表4。由此可知，模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，R2、AdjR2、PredR2均在可接受范圍內(nèi)，表明模型具有較高的擬合度和可信度；變異系數(shù)均小于10，表明模型精確度較高；信噪比>4，表明模型能較好地對提取工藝進(jìn)行分析預(yù)測；Y1、Y2一次項A、B、C均有顯著影響(P<0.05，P<0.01)，其排序與“2.4.1”項下一致，表明結(jié)果準(zhǔn)確性較高，并且Y1二次項AB及兩者平方項A2、B2、C2也均有顯著影響(P<0.05，P<0.01)。

表4 Box-Behnken響應(yīng)面法方差分析

響應(yīng)面分析見圖1～2，可知各因素對總黃酮、總酚酸提取率的影響程度相似，均主要為提取溫度和提取時間，并隨著兩者增加提取率先升后降，與單因素試驗結(jié)果一致；雖然粉碎程度對兩者提取率的影響均較為平緩，但整體而言，其程度較高仍是保證高提取率的必要條件。

圖1 各因素響應(yīng)面圖(總黃酮提取率)Fig.1 Response surface plots for various factors (extraction rate of total flavonoids)

圖2 各因素響應(yīng)面圖(總酚酸提取率)Fig.2 Response surface plots for various factors (extraction rate of total phenolic acids)

2.4.3 驗證試驗 根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)果，得到最優(yōu)工藝為提取時間33.2 min，提取溫度42.51 ℃，粉碎程度60目，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比40∶1，總黃酮、總酚酸提取率分別為34.44%、12.41%，根據(jù)實際情況，將其修正為提取時間33 min，提取溫度43 ℃，粉碎程度60目，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比40∶1。在上述優(yōu)化工藝下進(jìn)行3批驗證試驗，測得總黃酮提取率分別為34.87%、34.96%、34.84%，平均值34.89%；總酚酸提取率分別為11.41%、12.73%、12.49%，平均值12.21%，分別與預(yù)測值34.44%、12.41%接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 DPPH自由基清除能力 參考文獻(xiàn)[16]報道，并略作改動。取0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL提取物溶液各100 μL，與100 μL DPPH溶液(0.05 mg/mL)置于96孔板中充分混勻，37 ℃避光靜置20 min，在517 nm波長處測定吸光度Ai；用乙醇代替提取物，在相同條件下測定吸光度A0；用乙醇代替DPPH溶液，在相同條件下測定吸光度Aj，以L-抗壞血酸為陽性對照，重復(fù)3次，計算對DPPH自由基的清除率，公式為清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%，結(jié)果見圖3。由此可知，提取物對DPPH自由基的清除率與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，IC50為0.012 mg/mL。

圖3 提取物對DPPH自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of extract on DPPH free radical

2.5.2 羥基自由基清除能力 采用Fenton反應(yīng)，其機(jī)制為H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH，在該體系中加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，抗氧化物能清除·OH而使體系顏色變淺，可間接檢測·OH含量[17]。取0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL提取物溶液各400 μL，依次加入9.0 mmol/L FeSO4溶液、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液各200 μL，混勻后37 ℃靜置30 min，在510 nm波長處測定吸光度Ai；用乙醇代替提取物，在相同條件下測定吸光度A0；用純水代替H2O2溶液，在相同條件下測定吸光度Aj，以L-抗壞血酸為陽性對照，重復(fù)3次，計算對羥基自由基的清除率，公式為清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%，結(jié)果見圖4。由此可知，提取物對羥基自由基的清除能力隨著其質(zhì)量濃度增加而升高，IC50為0.72 mg/mL。

圖4 提取物對羥基自由基的清除率Fig.4 Scavenging rates of extract on hydroxyl free radical

2.5.3 總還原能力 參考文獻(xiàn)[18]報道，并略作改動。取0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL提取物溶液各250 μL，加入250 μL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、250 μL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃恒溫反應(yīng)20 min后置于冰盒中迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液250 μL，混勻后5 000 r/min離心10 min，取上清500 μL，加入400 μL蒸餾水、100 μL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，以L-抗壞血酸為陽性對照，在700 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次，結(jié)果見圖5。由此可知，吸光度在一定范圍內(nèi)隨者其質(zhì)量濃度增加呈線性增長，即總還原能力逐漸增強(qiáng)。

圖5 提取物總還原能力Fig.5 Total reduction capacity of extract

2.6 抗菌活性研究 采用K-B法，凍干粉用甲醇溶解制成50 mg/mL工作液，稀釋后分多次滴加于滅菌紙片(6 mm)上，制得載藥量分別為2、1、0.5 mg的載藥紙片，同時以浸泡甲醇的紙片為空白對照。將紙片貼附于事先涂布100 μL菌懸液(1×105CFU/mL)的MH瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h后測定抑菌圈直徑，判定標(biāo)準(zhǔn)為高敏(直徑>20 mm)、中敏(直徑10～20 mm)、輕敏或耐藥(直徑<10 mm)，結(jié)果見圖6。由此可知，提取物對各菌株均有較顯著的抑制作用，表現(xiàn)為輕敏或中敏，并呈量效關(guān)系。

圖6 提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of extract on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 討論與結(jié)論

黃酮和酚酸是植物中生物活性廣泛的2類成分，具有重要的研發(fā)價值，故本實驗優(yōu)化馬蹄黃中兩者提取工藝。目前，關(guān)于該植物所含成分的基礎(chǔ)研究有限，故分別以蘆丁、沒食子酸當(dāng)量為兩者含量進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)影響其提取率的條件存在一定差異，可能與理化性質(zhì)有關(guān)。Box-Behnken響應(yīng)面法中各因素的顯著性與Plackett-Burman設(shè)計一致，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，同時驗證試驗結(jié)果與預(yù)測值一致，表明最優(yōu)工藝穩(wěn)定可靠。

抗氧化活性實驗結(jié)果顯示，馬蹄黃提取物對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，但清除率最高僅在80%左右，可能與完全清除DPPH后產(chǎn)生的淡黃色背景有關(guān)；對羥基自由基的清除能力較弱，其原因可能是反應(yīng)體系中H2O2與Fe2+反應(yīng)所產(chǎn)生的Fe3+與提取物中的酚類結(jié)合，形成藍(lán)黑色產(chǎn)物，致使吸光度偏高，故清除率隨著其質(zhì)量濃度增加表現(xiàn)出更平緩的增長趨勢?？傔€原能力實驗結(jié)果顯示，馬蹄黃提取物具有較強(qiáng)的Fe2+還原能力。藥敏實驗結(jié)果顯示，馬蹄黃提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用。

綜上所述，本實驗所優(yōu)化的馬蹄黃總黃酮、酚酸提取工藝穩(wěn)定可靠，提取物具有較好的抗氧化、抗菌活性，可為該植物開發(fā)利用提供參考。