順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中腎臟組織m6A甲基化水平的變化

沈劍簫，王萬鵬，邵興華，吳晶魁，李 舒，車霞靜，倪兆慧

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎臟科，上海 200127；2.江蘇省漣水縣人民醫(yī)院腎臟科，漣水 223400

順鉑是一種常用的治療實(shí)體腫瘤的藥物，通過與細(xì)胞中的DNA相結(jié)合，干擾DNA與線粒體功能，發(fā)揮抗腫瘤作用，但其也具有腎毒性。在代謝過程中，順鉑逐漸匯聚于腎小管細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，引起急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）［1-3］。已有研究［4-6］發(fā)現(xiàn)凋亡、壞死、炎癥等均與順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷（cisplatin-induced AKI，CI-AKI）有關(guān)。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladnosine，m6A）甲基化修飾是mRNA 常見的調(diào)控方式。新的測序技術(shù)使人們可以深入研究m6A 對細(xì)胞生理功能的調(diào)控作用。目前的研究［7-8］發(fā)現(xiàn)m6A 修飾主要發(fā)生在“RRACH”序列中的腺嘌呤上（其中R=A 或G，H=A、C 或U），其功能由“編碼器（writer）”“讀（reader）”與“消碼器（eraser）”決定。編碼器也就是甲基轉(zhuǎn)移酶，是由甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase 3， METTL3）、 甲基轉(zhuǎn)移酶 14（methyltransferase 14， METTL14）、 WT1 相關(guān)蛋白（WT1 associated protein WTAP）、KIAA1429 等蛋白組合而成的復(fù)合物。讀碼器則是由具有YTH 結(jié)構(gòu)域的蛋白（包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3）及核不均一蛋白HNRNP 家族蛋白（包括HNRNPA2B1 和HNRNPC）組成。消碼器則是ALKB 同源染色體5（alkB homolog 5，ALKBH5）及FTO蛋白為代表的去甲基酶［9-10］。

部分研究分析了m6A 甲基化與AKI 間的關(guān)系。有研究［11］報(bào)道過Mettl3基因可有效抑制抗黏菌素誘導(dǎo)的小鼠腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。另一項(xiàng)研究［12］發(fā)現(xiàn)順鉑可誘導(dǎo)小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡，細(xì)胞中FTO 蛋白表達(dá)降低。在AKI 患者中，血清METTL14 水平升高［13］。但是，目前尚無研究通過高通量測序的方式檢測m6A 甲基化在順鉑誘導(dǎo)的AKI 中的變化。m6A 甲基化在CI-AKI 發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討。本研究建立了一種有效的CI-AKI小鼠模型，采用甲基化RNA免疫共沉淀技術(shù)（methylated RNA immunoprecipitation，MeRIP）檢測小鼠腎臟組織中m6A 甲基化水平的變化，采用RNA-seq 測序技術(shù)檢測mRNA 水平的變化，探索m6A甲基化在CI-AKI中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑、儀器

實(shí)驗(yàn)用小鼠為C57bL/6小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［生產(chǎn)許可證：SCXK （滬） 2017-0005］。RNA 分離劑、RNA 質(zhì)量檢測紫外分光光度計(jì)、血液離心機(jī)購自美國賽默飛公司；線粒體RNA 分離試劑盒、RNA 裂解液、高通量測序儀（Hiseq） 購自美國Illumina 公司；mRNA 分離提取試劑盒購自美國Arraystar公司；NEBNextR Ultra II RNA 建庫試劑盒購自美國New England生物實(shí)驗(yàn)室；m6A-RNA免疫共沉淀試劑盒購自上海云序生物科技有限公司；血液成分檢測機(jī)購自德國羅氏診斷有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與取材 8 只雄性8 周齡C57bL/6 小鼠隨機(jī)分至對照組與損傷組（每組4 只），統(tǒng)一飼養(yǎng)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司所屬動(dòng)物房［使用許可證：SYXK （滬） 2017-0008］。小鼠飼養(yǎng)于環(huán)境溫度20～22 ℃，相對濕度為40%～50%，恒溫、恒濕、獨(dú)立通氣鼠籠中，使用經(jīng)滅菌處理后的全價(jià)營養(yǎng)飼料與飲用水，給予晝夜明暗交替（12 h/12 h）光照。飼養(yǎng)14 d后，損傷組小鼠尾靜脈注射順鉑20 mg/kg，對照組尾靜脈注射等量生理鹽水，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。72 h 后斷頸處死所有小鼠，剝除小鼠眼球，采集外周血；切開腹腔，取出雙側(cè)腎臟。研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 血清肌酐與血尿素氮檢測 收集小鼠外周血，1 500×g離心10 min，收集上清液，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)分光光度法檢測血清肌酐與血尿素氮。

1.2.3 組織病理學(xué)分析 用生理鹽水清洗腎組織，10%福爾馬林固定，再用10%石蠟制片，切片5 片（厚度5 μm）后運(yùn)用蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡分析皮質(zhì)-髓質(zhì)交界腎小管受損情況。每組隨機(jī)選取8個(gè)標(biāo)本，在放大倍數(shù)為400倍的顯微鏡下觀察是否存在腎小管擴(kuò)張、刷狀緣丟失、腎小管壞死等變化，并評(píng)分［14］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為正常；1分為輕度（損傷小管占視野內(nèi)小管百分比≤10%）；2 分為中度（損傷小管占比>10%且≤25%）；3 分為嚴(yán)重（損傷小管占比>25%且≤50%）；4 分為非常嚴(yán)重（損傷小管占比>50%且≤75%）；5 分為最嚴(yán)重（損傷小管占比>75%）。

1.2.4 腎組織中m6A 檢測與分析 運(yùn)用TRIzol 溶解腎臟組織提取總RNA，使用線粒體RNA分離試劑盒從總RNA中去除線粒體RNA。用RNA 裂解液將RNA 分裂成約100 個(gè)核苷酸長度的片段。運(yùn)用紫外分光光度計(jì)檢測RNA 的質(zhì)量，變性瓊脂糖凝膠評(píng)估RNA 完整性。使用mRNA 分離試劑盒從總RNA 中分離mRNA，再運(yùn)用m6A RNA 共沉淀試劑盒將m6A 與RNA 共沉淀。運(yùn)用NEBNextR Ultra ⅡRNA 工具包構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫。運(yùn)用高通量測序儀檢測所有樣本，質(zhì)控要求為Q30（堿基質(zhì)量值錯(cuò)誤率小于0.1%）。運(yùn)用Cutadapt 軟件（v1.9.3）適配3'端并去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用Hisat2 軟件（v2.0.4）校準(zhǔn)及讀取參考基因組文庫。使用MACS（model-based analysis of ChIP-Seq）軟件分析確定RNA 上的m6A 甲基化位點(diǎn)。使用motif 富集軟件對m6A 甲基化位點(diǎn)進(jìn)行富集分析，并使用R-package MetaPlotR 軟件對m6A 甲基化位點(diǎn)在基因及染色體上的分布進(jìn)行分類［15］。運(yùn)用DREME 軟件評(píng)估位點(diǎn)所修飾的堿基序列。將不同組間差異m6A 甲基化表達(dá)變化倍數(shù)≥2 且P<0.05 的位點(diǎn)作為顯著差異的界限。運(yùn)用diffReps 差異分析軟件分析這些位點(diǎn)甲基化水平變化。最后使用基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進(jìn)行結(jié)果可視化和綜合研究。

1.2.5 腎組織RNA 測序與分析 使用TRIzol從腎臟樣本中提取總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA 完整性。用mRNA 分離試劑盒分離mRNA。使用BGISEQ-500平臺(tái)將mRNA 碎片適配為50 bp 單鏈。使用SOAPnuke 軟件去除低質(zhì)量碎片，使用bowtie2 軟件將這些數(shù)據(jù)與軟件自身參考基因組比對。使用cuffdiff 軟件分析2 組小鼠之間差異表達(dá)基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠CI-AKI模型的建立

本研究成功構(gòu)建了順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI 模型。結(jié)果顯示：在損傷組中，給予小鼠尾靜脈注射順鉑20 mg/kg可使血清肌酐與血尿素氮水平顯著升高（圖1A、B）。腎臟病理分析結(jié)果提示順鉑可顯著誘導(dǎo)腎臟結(jié)構(gòu)損傷：損傷組小鼠的腎臟中可見廣泛的腎小管空泡化變性，上皮細(xì)胞剝脫，腎小管壞死等病理改變（圖1C、D）。血清肌酐、血尿素氮及腎臟病理結(jié)果均提示AKI造模成功。

圖1 順鉑誘導(dǎo)的C57bL/6小鼠AKI模型建立Fig 1 Establishment of CI-AKI model in C57bL/6 mice

2.2 對照組與損傷組之間m6A甲基化水平變化的比較

對照組4 個(gè)樣本中共有7 942 個(gè)mRNA 含13 284 個(gè)m6A 位點(diǎn)，損傷組4 個(gè)樣本共有7 422 個(gè)轉(zhuǎn)錄本含11 846個(gè)m6A 位點(diǎn)。損傷組與對照組相比，9 008 個(gè)位點(diǎn)一致（圖2A）。從2組中各隨機(jī)選擇1份樣本，并從2份樣本中各選擇1 000 個(gè)甲基化水平最高的位點(diǎn)，2 組中m6A 甲基化修飾的常見序列均為“RRACH”保守序列（圖2B）。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，含有1個(gè)m6A甲基化位點(diǎn)的基因只占對照組全部含甲基化位點(diǎn)基因的16.6%，在損傷組中這一比例為21.2%；超過75.0%的含有甲基化位點(diǎn)的基因含有2個(gè)或以上的m6A甲基化位點(diǎn)（圖2C）。

圖2 對照組和損傷組mRNAs中m6A變化情況Fig 2 Overview of m6A methylation within mRNAs in the control group and the injury group

為了分析甲基化位點(diǎn)在基因上的分布區(qū)域，將基因按結(jié)構(gòu)分為5 個(gè)區(qū)域，即5′端、啟動(dòng)編碼區(qū)域、編碼序列（coding sequence，CDS）區(qū)域、終止編碼區(qū)域與3′端。結(jié)果顯示，m6A在CDS區(qū)域最豐富，其次是終止編碼區(qū)域。損傷組中m6A甲基化位點(diǎn)在終止編碼區(qū)域更多（圖2D）。

進(jìn)一步將損傷組與對照組甲基化位點(diǎn)進(jìn)行比對后，共有2 227 個(gè)基因中的2 981 個(gè)甲基化位點(diǎn)存在差異表達(dá)。損傷組相比對照組，在2 981 個(gè)差異化位點(diǎn)中48.2%的位點(diǎn)甲基化水平升高。表1展示了m6A甲基化水平變化最大的20 個(gè)位點(diǎn)。將這些差異表達(dá)位點(diǎn)進(jìn)行染色體歸類后發(fā)現(xiàn)：4 號(hào)、2 號(hào)、7 號(hào)與11 號(hào)染色體含有最多的差異m6A甲基化位點(diǎn)（differentially methylated m6A site，DMMS）（圖3A）。將位點(diǎn)數(shù)除以染色體平均長度后，發(fā)現(xiàn)11 號(hào)、19號(hào)、7號(hào)及4號(hào)染色體含有的DMMS密度最高（圖3B）。同時(shí)，CDS區(qū)域含有大部分DMMS（圖3C）；5′端甲基化位點(diǎn)上調(diào)倍數(shù)較高，3′端甲基化位點(diǎn)下調(diào)幅度較大（圖3D）。這些數(shù)據(jù)揭示了不同基因甲基化與去甲基化的趨勢。

圖3 DMMS在染色體上分布情況Fig 3 Distribution of DMMSs in chromosomes

表1 甲基化水平變化差異最大的20個(gè)m6A甲基化位點(diǎn)Tab 1 Top 20 differentially methylated m6A peaks

2.3 含有DMMS的基因的重要通路

運(yùn)用GO 富集分析和KEGG 通路分析探索了2 組中含有DMMS 的基因的生物學(xué)功能。從生物過程角度來看，含有m6A 甲基化上調(diào)位點(diǎn)的基因多富集于細(xì)胞代謝與死亡進(jìn)程，比如大分子代謝、細(xì)胞代謝、凋亡、細(xì)胞死亡過程等（圖4A）。而含有m6A 甲基化下調(diào)位點(diǎn)的基因富集于細(xì)胞代謝、氧化、轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程（圖4B）。KEGG 通路分析則提示相關(guān)基因參與了包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、P53等凋亡相關(guān)通路中（圖4C）。含有m6A 甲基化下調(diào)位點(diǎn)的基因富集于增殖、碳代謝、氧化磷酸化等過程（圖4D）。通路分析提示基因主要富集于催化活性、離子結(jié)合、輔酶結(jié)合、輔因子結(jié)合等通路。這些結(jié)果提示m6A在CI-AKI 發(fā)生、發(fā)展中參與了代謝、細(xì)胞死亡、氧化等多種進(jìn)程。

圖4 GO與KEGG分析包含DMMS的編碼基因Fig 4 GO and KEGG analyses of coding genes containing DMMSs

2.4 m6A修飾與基因調(diào)控的聯(lián)合分析

應(yīng)用RNA-seq 技術(shù)檢測對照組和損傷組間差異表達(dá)基因。共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因4 469 個(gè)（表達(dá)變化倍數(shù)≥2，P<0.05），其中下調(diào)基因1 655 個(gè)，上調(diào)基因2 814 個(gè)。將含有DMMS 的基因與差異表達(dá)基因取交集，共得出1 002 個(gè)基因。這些基因可分為4 類，包括576 個(gè)甲基化水平升高且RNA 表達(dá)上調(diào)的基因，422 個(gè)甲基化水平降低且RNA 表達(dá)下調(diào)的基因，1 個(gè)甲基化水平升高且RNA表達(dá)下調(diào)的基因和3 個(gè)甲基化水平降低且RNA 表達(dá)上調(diào)的基因（圖5A）。

深入分析甲基化與基因表達(dá)趨勢相同的基因后，發(fā)現(xiàn)部分基因含有生理學(xué)功能。如順鉑可促進(jìn)編碼纖維蛋白原的纖維蛋白原α 鏈（fibrinogen α chain，F(xiàn)ga）基因中甲基化位點(diǎn)變化趨勢和mRNA 表達(dá)趨勢均升高（圖5B）。介導(dǎo)Na+與K+離子跨膜運(yùn)動(dòng)的溶質(zhì)載體12家族成員1（solute carrier family 12 member 1，Slc12a1）基因受順鉑刺激后mRNA 甲基化位點(diǎn)變化趨勢和mRNA 表達(dá)趨勢均降低（圖5C）。順鉑也可誘導(dǎo)甲肝病毒細(xì)胞受體1（hepatitis A virus cellular receptor 1，Havcr1）基因mRNA中m6A甲基化水平升高，mRNA高表達(dá)（圖5D）。

圖5 差異甲基化基因和差異表達(dá)基因的聯(lián)合分析Fig 5 Conjoint analysis of differentially methylated genes and differentially expressed genes

3 討論

m6A 甲基化在許多物種中被認(rèn)為是一種可逆的動(dòng)態(tài)修飾。既往研究［16-18］表明，m6A 修飾可以通過影響mRNA 的轉(zhuǎn)錄、剪接、定位、翻譯、穩(wěn)定性以及RNA 水平上的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)應(yīng)答各種生理刺激。也有證據(jù)［11-13］提示m6A 修飾與腎損傷之間存在密切關(guān)系，揭示了m6A 在腎損傷調(diào)節(jié)中的重要生物學(xué)作用。

本研究建立了一種穩(wěn)定可靠的CI-AKI 小鼠模型，并通過血清肌酐、血尿素氮檢測和腎組織病理分析證實(shí)了建模成功。不同的外界刺激可導(dǎo)致腎臟中m6A 的動(dòng)態(tài)修飾和基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，順鉑誘導(dǎo)小鼠腎組織中mRNA 甲基化水平和基因表達(dá)量均發(fā)生變化，且m6A 甲基化修飾的常見序列為“RRACH”保守序列。這一結(jié)果與其他研究一致［19-20］。同時(shí)，超過75.0%的含有甲基化位點(diǎn)的基因含有2個(gè)或以上的m6A甲基化位點(diǎn)，這一結(jié)果與前期在腦［19］和肝［20］等臟器中的研究結(jié)果不一致，提示腎臟組織有一定特殊性。2組中m6A 甲基化含量豐富的區(qū)域均位于基因的CDS 區(qū)域，這與部分已有研究結(jié)果一致［18-20］。進(jìn)一步運(yùn)用GO 和KEGG 分析含有DMMS 的基因發(fā)現(xiàn)：甲基化水平升高（含有m6A 甲基化上調(diào)位點(diǎn)）的基因主要富集在代謝和細(xì)胞死亡相關(guān)的通路中，如大分子代謝、細(xì)胞代謝、TNF 信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路；甲基化水平降低（含有m6A 甲基化下調(diào)位點(diǎn)）的基因主要集中在代謝、氧化和轉(zhuǎn)運(yùn)通路中，說明順鉑導(dǎo)致了復(fù)雜的m6A 甲基化變化。所涉及的通路中已有多條通路被證實(shí)是CI-AKI 的影響因素。其中，代謝相關(guān)通路的變化可能是構(gòu)成CI-AKI 病理生理變化的基礎(chǔ)。

最后，本研究結(jié)合m6A 修飾和基因調(diào)控探索了CIAKI 的可能發(fā)生機(jī)制。將轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)與表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)整合分析得到的1 002 個(gè)基因中，絕大部分基因中m6A甲基化趨勢與基因表達(dá)趨勢一致，這與文獻(xiàn)報(bào)道相同［19-21］，提示順鉑可能通過影響這些基因的m6A 甲基化水平進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄組水平變化。這為進(jìn)一步研究CI-AKI機(jī)制提供了新的思路。同時(shí)，有幾個(gè)變化的基因引起了我們的注意。例如，順鉑誘導(dǎo)小鼠腎臟中Fga基因甲基化水平和表達(dá)水平均上調(diào)，且Fga是編碼纖維蛋白原的關(guān)鍵基因。順鉑可引起腎臟血管內(nèi)皮損傷和廣泛的炎癥反應(yīng)，激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)［22-24］。本研究結(jié)果則提示順鉑對m6A 甲基化水平的影響可能是Fga基因表達(dá)水平變化的重要原因。Slc12a1 是袢利尿劑的分子靶點(diǎn)［25-27］。Sc12a1 介導(dǎo)Na+和K+的跨膜運(yùn)動(dòng)，順鉑破壞小管轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和K+等離子的功能。在本研究中，Slc12a1在順鉑的刺激下甲基化水平下調(diào)并低表達(dá)，這提示順鉑對離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的破壞可能部分通過影響關(guān)鍵基因Slc12a1mRNA 上的m6A 甲基化水平實(shí)現(xiàn)。Harvc1 已被證實(shí)可作為腎損傷預(yù)測的標(biāo)志物［28-30］。有報(bào)道［31］表明，Harvc1通過介導(dǎo)吞噬作用減輕急性腎臟損傷。本研究結(jié)果表明順鉑誘導(dǎo)Harvc1mRNA 的m6A 甲基化水平升高，提示m6A 甲基化可能也是Harvc1 發(fā)揮作用的機(jī)制之一，這為進(jìn)一步研究Harvc1在腎臟疾病中的功能提供了思路。

綜上，本研究通過比較正常小鼠與CI-AKI 小鼠模型中腎臟組織的m6A 甲基化及RNA 表達(dá)差異，表明m6A 甲基化與CI-AKI 之間存在重要關(guān)聯(lián)。此外，獲得的候選基因揭示了m6A 甲基化與CI-AKI 之間可能存在的關(guān)聯(lián)。但本研究仍存在一些不足。目前尚無法確定觀測到的m6A變化是由順鉑直接導(dǎo)致，還是在AKI 過程中細(xì)胞生理活動(dòng)變化后發(fā)生，這也是我們今后的研究方向。課題組擬在下一步研究中結(jié)合其他研究中的數(shù)據(jù)和體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)明確順鉑對m6A甲基化的影響。