HRAS 基因單核苷酸多態(tài)性與精神分裂癥及非典型抗精神病藥物療效的關(guān)聯(lián)研究

李 睿，曾 端，和 申，沈一峰，李華芳，2，3

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心精神科，上海 200030；2.上海市精神心理疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200030；3.上海市重性精神病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200030

精神分裂癥是一種常見(jiàn)的高度異質(zhì)性重性精神疾病，病程長(zhǎng)，常遷延不愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和社會(huì)功能，其病因及發(fā)病機(jī)制至今未明。HRAS原癌基因（HRASproto-oncogene，HRAS）是RAS基因家族三大原癌基因之一，位于人類11號(hào)染色體短臂上（11p15.1～p15.3）。該基因編碼的RAS 蛋白，又稱為P21 蛋白，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，具有鳥(niǎo)苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）活性，與GTP 和GDP 有很強(qiáng)的親和性；其控制的下游通路包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK） 、 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K） 以及磷脂酶C（phospholipases C，PLC）通路等，而已有研究提示這些通路與精神分裂癥密切相關(guān)［1-4］。HRAS在精神疾病中的研究也較多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因與酒精依賴［5］、認(rèn)知功能［6］和自閉癥［7］有關(guān)。有關(guān)精神分裂癥的基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）研究［8-10］已有不少，然而尚無(wú)研究報(bào)道中國(guó)漢族人群中HRAS基因與精神分裂癥及非典型抗精神病藥物療效的相關(guān)性。本研究旨在探討HRAS基因rs11246176 位點(diǎn)多態(tài)性與精神分裂癥及非典型抗精神病藥物療效的相關(guān)性。

在課堂上，教師可以利用虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)設(shè)置包括導(dǎo)游講解技巧和流程、處理突發(fā)事件、滿足游客需求等任務(wù)的情景模擬，通過(guò)技能分解，幫助學(xué)生全方位感知自己的操作技能，提高課堂教學(xué)與實(shí)踐實(shí)訓(xùn)的相似度，讓學(xué)生在課堂上完成導(dǎo)游實(shí)戰(zhàn)模擬，培養(yǎng)智慧型導(dǎo)游服務(wù)人才，大大縮減了學(xué)生就業(yè)后的適應(yīng)時(shí)間，提高學(xué)生對(duì)于社會(huì)崗位的適應(yīng)能力。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2010年11月至2019年12月入組非典型抗精神病藥物治療精神分裂癥長(zhǎng)期結(jié)局的真實(shí)世界的多中心臨床研究（the Multi-center Real World Clinical Study of Long-term Outcomes for Schizophrenia by Atypical Antipsychotic Treatment，SALT-C）［11］的460 例精神分裂癥患者作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)（第4 版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，4th edition，DSM-Ⅳ）中精神分裂癥診斷。②性別不限，漢族，年齡大于18 周歲。③患者陽(yáng)性與陰性癥狀量表（Positive and Negative Syndrome Scale，PANSS）總分≥60分，處于急性期。④患者正在或?qū)⒁梅堑湫涂咕癫∷幬?，包括喹硫平、奧氮平、利培酮、阿立哌唑、齊拉西酮、帕利哌酮、氨磺必利和氯氮平，入組時(shí)至少2周服用非典型抗精神病藥物種類不變。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者同時(shí)參與其他臨床研究。②有其他精神疾病。③患者不適合進(jìn)行本研究的情況，例如同時(shí)患有腫瘤、肝功能不全或處于妊娠及哺乳期等。

共納入386名健康對(duì)照者作為對(duì)照組，排除精神病史及精神疾病家族史，無(wú)物質(zhì)濫用史及嚴(yán)重軀體疾病。

本研究由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)為2010-35），并獲得所有受試者或其監(jiān)護(hù)人簽署的同意書(shū)。

根據(jù)PANSS減分率將455例患者劃分為有效組132例和無(wú)效組323 例。有效組與無(wú)效組年齡、性別、PANSS基線評(píng)分、發(fā)病年齡、病程、用藥劑量及基線用藥情況方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05，表1）。有效組97 例基線用藥患者用藥時(shí)長(zhǎng)9（4～33）年，無(wú)效組217 例基線用藥患者用藥時(shí)長(zhǎng)16（6～33）年，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.108）。

1.2 方法

《經(jīng)濟(jì)學(xué)人》中國(guó)專欄的報(bào)道并非只有諷刺或消極類，也有一些報(bào)道對(duì)中國(guó)的經(jīng)濟(jì)狀況或現(xiàn)象持肯定態(tài)度。2016年6月11日的中國(guó)專欄中，其中有一篇報(bào)道了關(guān)于溫州經(jīng)濟(jì)的現(xiàn)狀。該報(bào)道中包含三則概念隱喻——“對(duì)抗金融危機(jī)是戰(zhàn)爭(zhēng)”、“銀行是人”和“經(jīng)濟(jì)發(fā)展是旅程”。在“對(duì)抗金融危機(jī)是戰(zhàn)爭(zhēng)”概念隱喻中，金融危機(jī)對(duì)應(yīng)于敵人，對(duì)抗金融危機(jī)對(duì)應(yīng)于戰(zhàn)爭(zhēng)（例14）。在“銀行是人”概念隱喻中，銀行逐漸從金融危機(jī)的陰影中走出來(lái)對(duì)應(yīng)于人逐漸恢復(fù)健康（例15）。在“經(jīng)濟(jì)發(fā)展是旅程”概念隱喻中，用于承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)對(duì)應(yīng)于勇敢面對(duì)旅途中的危險(xiǎn)（例16）。

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，A 等位基因攜帶者（AA+AG）在入組26 周后的減分率顯著高于GG 基因型攜帶者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010，表4）。

采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料符合正態(tài)分布和方差齊性時(shí)用±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較；不符合正態(tài)分布和方差齊性時(shí)，用M（Q1，Q3）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。定性資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用非條件Logistic 回歸進(jìn)行不同遺傳模式下位點(diǎn)多態(tài)性與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析。采用重復(fù)測(cè)量方差分析對(duì)不同基因型患者在基線、入組13 周和入組26 周時(shí)的PANSS 總分及PANSS 減分率進(jìn)行評(píng)估，年齡和性別作為協(xié)變量。P<0.05（雙側(cè)檢驗(yàn)）表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

460 例患者中男性220 例，女性240 例，平均年齡（48.40±18.16）歲，發(fā)病年齡（26.45±10.43）歲，平均病程（23.79±15.93） 年，入組時(shí)PANSS 總分為（75.30±12.79）分，患者服用的非典型抗精神病藥物轉(zhuǎn)換為奧氮平的平均劑量為（14.89±23.76）mg/d。健康對(duì)照組中男性292 例，女性94 例，平均年齡（26.39±5.65）歲。2 組性別、年齡差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.001）?；颊咧杏? 例基因分型失敗，對(duì)照組中3 名基因分型失敗，因此將455 例患者和383 名健康對(duì)照者納入后續(xù)研究。重復(fù)測(cè)量10%的樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，結(jié)果100%一致。

1.2.1 臨床療效評(píng)定 納入的460 例精神分裂癥患者均接受非典型抗精神病藥物治療，根據(jù)世界衛(wèi)生組織藥物統(tǒng)計(jì)方法合作中心提出的限定日劑量（defined daily dose，DDD）進(jìn)行了等效劑量轉(zhuǎn)換，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為奧氮平的劑量［12］。藥物療效的評(píng)估采用PANSS，在入組時(shí)（基線）、入組13 周和入組26 周各評(píng)估1 次。評(píng)定療效的指標(biāo)為PANSS 減分率，其計(jì)算公式及界定值均參照相關(guān)文獻(xiàn)［13-14］，PANSS減分率=（基線得分-終點(diǎn)得分）/（基線得分-30）×100%，將PANSS 減分率≥50%定義為有效，PANSS減分率<50%定義為無(wú)效。

為研究沿海鋼管板樁碼頭受力特性，本文以福建泉州某鋼管樁碼頭為實(shí)例對(duì)象，通過(guò)建立二維、三維數(shù)學(xué)模型，對(duì)碼頭受力特性進(jìn)行詳細(xì)分析，并對(duì)比兩種計(jì)算方法的精度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SHEsis 軟件進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗(yàn)以及組間等位基因和基因型分布頻率差異檢驗(yàn)，運(yùn)用SNPStats 在線分析軟件評(píng)估4 種遺傳模式（加性、顯性、共顯性、隱性）下rs11246176 不同基因型與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)。使用QUANTO1.2.4 計(jì)算樣本的統(tǒng)計(jì)效能，假設(shè)患病率為1%［16］，OR值為1.3［17］，最小等位基因頻率為0.123［18］，則樣本的統(tǒng)計(jì)效能為96.26%。

表1的課程設(shè)計(jì)主要依據(jù)多元識(shí)讀教學(xué)法的理論框架、教學(xué)模式和獨(dú)立學(xué)院多元識(shí)讀的教學(xué)模型。該教材每單元需分配12學(xué)時(shí)來(lái)完成，本塊對(duì)涉及的閱讀文本進(jìn)行了詳細(xì)的課程設(shè)計(jì)。該表格總共分為5個(gè)步驟，并分為6個(gè)模塊進(jìn)行相應(yīng)的指導(dǎo)，分別為任務(wù)描述，訓(xùn)練技能，設(shè)計(jì)重點(diǎn)，模態(tài)選擇，教學(xué)模式和完成形式。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征的組間比較

1.2.3 表達(dá)數(shù)量性狀基因座分析 采用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)BrainCloud （http：//braincloud.jhmi.edu/）［15］對(duì)HRASrs11246176 位點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)數(shù)量性狀基因座（expression quantitative trait loci，eQTL）分析，探討不同基因型在大腦中的表達(dá)。BrainCloud 數(shù)據(jù)集由人腦基因組學(xué)聯(lián)盟BrainSeq 建立，是使用Illumina Human 49K Oligo 芯片生成的。HRAS基因rs11246176 位點(diǎn)包含268 例正常高加索人和非裔美國(guó)人背外側(cè)前額葉皮層（dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC）的樣本。

其一，PBL教學(xué)模式在調(diào)動(dòng)高職院校學(xué)生英語(yǔ)口語(yǔ)訓(xùn)練動(dòng)力與興趣方面的作用；其二，PBL教學(xué)模式在提高學(xué)生英語(yǔ)口語(yǔ)表達(dá)能力上的作用與具體表現(xiàn)；其三，PBL教學(xué)模式在提高學(xué)生綜合素質(zhì)方面的作用。

表1 有效組和無(wú)效組間臨床特征比較Tab 1 Comparison of clinical features between the responder group and non-responder group

2.2 病例組與對(duì)照組rs11246176多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

rs11246176 位點(diǎn)分型結(jié)果顯示其符合HWE （P>0.05）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)病例組與對(duì)照組的等位基因及基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05，表2）。病例組和對(duì)照組的基因型經(jīng)非條件Logistic 回歸分析，對(duì)性別、年齡進(jìn)行校正后發(fā)現(xiàn)在4 種遺傳模式下，rs11246176 位點(diǎn)多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（均P>0.05，表3）。

表2 rs11246176位點(diǎn)等位基因及基因型頻率在不同組別間的比較Tab 2 Comparison of allele and genotype frequencies between the case group and control group

表3 不同遺傳模式下rs11246176位點(diǎn)基因型與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析Tab 3 Correlation analysis between rs11246176 genotype and incidence risk in different genetic models

2.3 有效組與無(wú)效組rs11246176多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

有效組中A 等位基因頻率顯著高于無(wú)效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.943，P＝0.010，表2）。有效組中AA和AG 基因型頻率顯著高于無(wú)效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.332，P＝0.040，表2）。

2.4 不同基因型患者非典型抗精神病藥物治療效果比較

1.2.2 SNP 基因分型 采用DNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取患者外周血基因組DNA。采用TaqMan檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）對(duì)HRAS基因rs11246176 位點(diǎn)進(jìn)行分型。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 總反應(yīng)體系為5 μL，包括2.50 μL master mix、2.25 μL DNA 模板和0.25 μL TaqMan 探針。反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，50 個(gè)循環(huán)。在ABI PRISM?7900 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上讀取結(jié)果。

表4 rs11246176不同基因型PANSS總分及減分率的比較（±s）Tab 4 Comparison of PANSS total scores and reduction rates of total scores among different genotypes of rs11246176（±s）

Note: ①Comparison of reduction rates of total scores between AA+AG genotype and GG genotype. ②Comparison of reduction rates of total scores between AA genotype and AG+GG genotype.

PANSS total score/score Time ①②PAA+AG/GG PAA/AG+GG Baseline 13 weeks 26 weeks AA 73.08±10.00 57.46±13.75 55.15±15.56 AG 76.47±11.71 58.38±15.48 61.63±17.93 GG 75.08±13.28 55.15±15.56 64.23±17.11 Reduction rate of total score/%AA-37.01±23.94 42.09±33.87 AG-35.39±40.17 30.99±33.65 GG-31.06±41.33 22.70±34.84 0.672 0.077 0.293 0.010

2.5 eQTL分析

eQTL 分析發(fā)現(xiàn)HRAS基因rs11246176 位點(diǎn)在268 例高加索人和非裔美國(guó)人的DLPFC 不同基因型的表達(dá)水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs11246176 AA 型HRASmRNA 表達(dá)水平最高，其次為AG 型，GG 型表達(dá)水平最低（P=0.000，圖1）。

圖1 基于BrainCloud數(shù)據(jù)庫(kù)的HRAS基因rs11246176多態(tài)性的eQTL分析Fig 1 eQTL analysis of rs1246176 in HRAS gene based on the BrainCloud database

3 討論

本研究報(bào)道了HRAS基因rs11246176 位點(diǎn)多態(tài)性的基因型和等位基因頻率在中國(guó)漢族正常人群和精神分裂癥人群中的分布，以及該位點(diǎn)多態(tài)性與非典型抗精神病藥物療效的關(guān)系。本研究未發(fā)現(xiàn)rs11246176 等位基因和基因型頻率在病例組與對(duì)照組之間存在差異，但發(fā)現(xiàn)了非典型抗精神病藥物治療有效組的A 等位基因頻率顯著高于無(wú)效組，有效組中AA 和AG 基因型頻率也顯著高于無(wú)效組。在治療的第26 周末，各基因型間PANSS 總分減分率比較結(jié)果顯示，A 等位基因攜帶者的PANSS 減分率顯著高于GG 基因型。因此，本研究推測(cè)rs11246176 位點(diǎn)可能與非典型抗精神病藥物的療效有關(guān)，A等位基因攜帶者的非典型抗精神病藥物療效較好。

HRAS基因編碼的蛋白具有GTPase 活性，是生長(zhǎng)分化過(guò)程中重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子開(kāi)關(guān)。早在1996 年Comings等［7］就報(bào)道了HRAS基因的缺陷可能影響G蛋白參與的第二信使信號(hào)途徑，且與自閉癥及強(qiáng)迫癥這類行為障礙的精神疾病有關(guān)［19］。雖然我們的研究未發(fā)現(xiàn)HRASrs11246176 多態(tài)性在精神分裂癥患者和健康對(duì)照間的差異，但發(fā)現(xiàn)在有效組和無(wú)效組間基因型和等位基因頻率分布存在顯著差異。有學(xué)者推測(cè)細(xì)胞凋亡與精神分裂癥的病理生理過(guò)程有關(guān)［20］，有研究［21-22］發(fā)現(xiàn)HRAS基因能夠通過(guò)PI3K 激活絲氨酸/蘇氨酸激酶（PKB/Akt）或激活核因子κB（NF-κB）來(lái)保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。我們通過(guò)eQTL 分析發(fā)現(xiàn)A 等位基因攜帶者的HRASmRNA 表達(dá)水平顯著高于GG 基因型，因此我們推測(cè)攜帶A 等位基因的個(gè)體可能通過(guò)上調(diào)HRASmRNA的表達(dá)導(dǎo)致原癌基因持續(xù)表達(dá)，細(xì)胞凋亡減少［23］，從而緩解精神分裂癥病理生理過(guò)程中的細(xì)胞凋亡增加現(xiàn)象；已有研究［24］發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者額葉皮質(zhì)細(xì)胞凋亡增加，且非典型抗精神病藥物可以通過(guò)改變凋亡反應(yīng)發(fā)揮治療作用。

本研究也存在一定的局限性。首先，本研究只探索了HRAS基因的rs11246176 位點(diǎn)，沒(méi)有研究其他位點(diǎn)，結(jié)論具有一定的局限性；其次，未將非典型抗精神病藥物進(jìn)行分類，可能導(dǎo)致混雜偏倚；再者，本研究是真實(shí)世界研究，故研究入組時(shí)并未嚴(yán)格限制患者既往的用藥情況，在一定程度上影響結(jié)果的確定性。但經(jīng)分析，有效組和無(wú)效組在基線時(shí)用藥和未用藥的比例，以及已用藥患者的用藥時(shí)長(zhǎng)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，雖然患者服藥對(duì)結(jié)果有一定影響，但我們可以認(rèn)為rs11246176 位點(diǎn)可能與非典型抗精神病藥物的療效有關(guān)。

綜上所述，HRAS基因rs11246176 多態(tài)性位點(diǎn)可能不是中國(guó)漢族人群精神分裂癥的發(fā)病相關(guān)位點(diǎn)，但可能與非典型抗精神病藥物療效有關(guān)。