SIRT3去SUMO 化修飾調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖及化療藥物敏感性的研究

郝艷云，俞思慧，陸 靜，顧 湘，張 帆，程金科#，王田實(shí)#

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)系，上海 200025；2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201620；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心物質(zhì)成癮科，上海 200030；4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼科，上海 200011；5.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200092

由致癌基因突變導(dǎo)致的細(xì)胞代謝重編程是引起腫瘤發(fā)生的主要原因［1］。越來(lái)越多的研究［2-3］表明，腫瘤細(xì)胞的代謝具有很高的可變性和靈活性。而線粒體作為能量代謝和氧化還原的主要場(chǎng)所，肩負(fù)著為腫瘤細(xì)胞的各種生理活動(dòng)提供能源（ATP）和維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)氧化-還原（redox）平衡的艱巨任務(wù)，這些過(guò)程對(duì)于腫瘤細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和增殖至關(guān)重要［4-5］。組學(xué)分析也證實(shí)了線粒體蛋白的乙?；揎椗c腫瘤代謝之間確實(shí)存在著相互影響［6］。

沉默調(diào)節(jié)蛋白3（sirtuin 3，SIRT3）是依賴于NAD+的去乙?；福饕嬖谟诰€粒體基質(zhì)中，是調(diào)控線粒體中能量代謝的關(guān)鍵因子［7］。越來(lái)越多的研究表明SIRT3能夠?qū)υS多參與線粒體氧化途徑的酶去乙?；?，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化以及能量生成［8］。SIRT3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也扮演著重要角色［9-12］。報(bào)道［13］證實(shí)SIRT3 能夠調(diào)節(jié)線粒體活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，抑制腫瘤細(xì)胞存活和增殖。近期研究［14］也發(fā)現(xiàn)，SIRT3 的缺失能通過(guò)減少三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA 循環(huán)）和乙酰輔酶A 庫(kù)中谷氨酰胺的量來(lái)誘導(dǎo)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞死亡。

類泛素蛋白（small ubiquitin-like modifier protein，SUMO）也是參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子。它能夠通過(guò)SUMO 特異性激活酶（E1）、結(jié)合酶（E2）和連接酶（E3）催化與靶蛋白中的賴氨酸殘基偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)靶蛋白的SUMO 化修飾（SUMOylation）。蛋白質(zhì)的SUMO化修飾是一種可逆反應(yīng)，受SUMO 特異性蛋白酶家族（sentrin-specific proteases，SENPs） 調(diào)控［15-16］。蛋白質(zhì)SUMO 化修飾會(huì)影響蛋白的細(xì)胞定位、活性以及穩(wěn)定性等。經(jīng)過(guò)20 多年的研究，蛋白質(zhì)的SUMO 化修飾已經(jīng)被報(bào)道廣泛參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)。因此，蛋白質(zhì)的SUMO 化修飾位點(diǎn)可能成為治療腫瘤的藥物靶點(diǎn)［17］。研究［16，18］證實(shí)，人的SIRT3蛋白能夠發(fā)生SUMO化修飾；在營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激的條件下，SIRT3 的SUMO 化修飾減少，可增強(qiáng)SIRT3 的活性，降低其底物的乙酰化水平，改善線粒體的應(yīng)激響應(yīng)能力。人的SIRT3 SUMO 化修飾位點(diǎn)是第288 位賴氨酸殘基，當(dāng)這一位點(diǎn)突變?yōu)榫彼幔↘288R）時(shí)，SIRT3 將不發(fā)生SUMO 化修飾，可增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化和脂肪酸代謝，改善線粒體乃至細(xì)胞的活性［16，18-19］。由此，我們推測(cè)SIRT3 的SUMO 化修飾也能夠影響腫瘤細(xì)胞的代謝增殖以及對(duì)化學(xué)治療（化療）藥物的敏感性。

乳腺癌的發(fā)病率近幾十年來(lái)一直呈上升的趨勢(shì)［20］，應(yīng)用抗癌藥物遏制腫瘤細(xì)胞已經(jīng)成為癌癥治療的重要手段之一［21］。阿霉素（adriamycin，ADM）是臨床上常用的廣譜抗腫瘤抗生素，它已經(jīng)被用于急性淋巴細(xì)胞白血?。?2］、淋巴瘤［23］、卡波西肉瘤［24］、乳腺癌［25］等癌癥的治療。但腫瘤治療過(guò)程中產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題一直是腫瘤治療的大難題，目前的腫瘤化療往往因?yàn)榛熋舾行缘投??；谝延袌?bào)道，我們認(rèn)為SIRT3 SUMO 化修飾通過(guò)調(diào)控其廣泛底物的乙?；剑绊懠?xì)胞內(nèi)ROS 水平和能量代謝水平，可能影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建SIRT3 SUMO 化位點(diǎn)突變的人乳腺癌細(xì)胞MCF7，來(lái)探討SIRT3的去SUMO 化修飾對(duì)腫瘤增殖及耐藥性的影響，以期發(fā)現(xiàn)提高腫瘤化療敏感性的新機(jī)制，為腫瘤的臨床治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（美國(guó)Gibco，10099141C），DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco，11995065），RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco，A1049101），B27 細(xì)胞培養(yǎng)添加劑（美國(guó)Gibco，17504044），表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）（美國(guó)Gibco，PHG0311L），MEGM 培養(yǎng)基（美國(guó)Lonza，CC-3150），青霉素-鏈霉素雙抗（美國(guó)Hyclone，SV30010）， Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen，L3000015），限制性內(nèi)切酶BbsⅠ（美國(guó)New England BioLabs，#R0539），T4 DNA 連接酶（美國(guó)New England BioLabs，#M0202），T4 多聚核苷酸激酶（美國(guó)New England BioLabs，#M0236），E. coli感受態(tài)細(xì)胞（中國(guó)TIANGEN， CB101）， pX330 質(zhì)粒（美國(guó)Addgene，#127875），Gag-pol 質(zhì)粒（美國(guó)Addgene，#14887），pVSV-G 質(zhì)粒（美國(guó)Addgene，#138479），抗SIRT3 抗體（美國(guó)CST，#5490），抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國(guó)CST，#4967），兔源二抗（美國(guó)CST，#7074P2），蛋白A瓊脂糖純化樹(shù)脂（中國(guó)YEASEN，36401ES25），阿霉素（美國(guó)Sigma，D1515）。pBABE-3×Flag 質(zhì)粒來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室?guī)齑妫?8］，抗SUMO1抗體由本實(shí)驗(yàn)室自行制備［26］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究主要使用的細(xì)胞系為人乳腺癌細(xì)胞（MCF7：美國(guó)ATCC，HTB-22），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。經(jīng)鑒定，該細(xì)胞系無(wú)支原體污染。該細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中，每周傳代2～3 次。本研究的所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 構(gòu)建用于敲除SIRT3基因的pX330-sgRNA 質(zhì)粒 利用美國(guó)麻省理工學(xué)院的CRISPR sgRNA 設(shè)計(jì)在線平臺(tái)（http：//crispr.mit.edu）設(shè)計(jì)sgRNA 的引物序列。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）查找人SIRT3基因的編碼序列，同時(shí)確定基因敲除位點(diǎn)。表1是最終合成的3對(duì)sgRNA引物。

表1 sgRNA引物信息Tab 1 Primers used for sgRNA

首先，用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ對(duì)pX330 質(zhì)粒在37 ℃下酶切30 min。同時(shí)，將合成的sgRNA 用T4 多聚核苷酸激酶在37 ℃孵育30 min，隨后在95 ℃作用5 min，每分鐘降低5 ℃直到25 ℃，完成磷酸化過(guò)程。然后，將磷酸化的sgRNA 與瓊脂糖凝膠回收的BbsⅠ酶切質(zhì)粒通過(guò)T4 DNA 連接酶連接。最后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆測(cè)序鑒定pX330-sgRNA 質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.2.3 構(gòu)建MCF7-SIRT3KO 細(xì)胞系 通過(guò)脂質(zhì)體Lipo3000 將pX330-sgRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF7細(xì)胞。首先，將轉(zhuǎn)染pX330-sgRNA 的MCF7 細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h 并計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞均勻移種到96 孔板中，加入DMEM 完全培養(yǎng)基開(kāi)始單克隆培養(yǎng)，通過(guò)24 孔板、6 孔板持續(xù)傳代培養(yǎng)1個(gè)月左右得到1×105個(gè)以上的細(xì)胞，然后一半用于鑒定，另一半移種到24 孔板繼續(xù)培養(yǎng)。用于鑒定的細(xì)胞系經(jīng)RIPA溶液［含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、0.3%NP40 和1%蛋白酶抑制劑］裂解變性，通過(guò)SDS-PAGE 和SIRT3 抗體檢測(cè)確定SIRT3KO 細(xì)胞株構(gòu)建成功。

1.2.4 構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒 通過(guò)設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的基因序列引物，將相應(yīng)的人的SIRT3基因序列插入到pBABE-3×Flag 的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建SIRT3 WT反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，具體引物序列見(jiàn)表2。

在SIRT3 WT 反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中，通過(guò)設(shè)計(jì)SIRT3 第288位賴氨酸編碼基因周圍的引物序列將該位點(diǎn)突變?yōu)榫彼?，使相?yīng)質(zhì)粒表達(dá)的SIRT3 蛋白不能夠發(fā)生SUMO化修飾，且結(jié)構(gòu)電荷不發(fā)生過(guò)多改變，從而構(gòu)建SIRT3 K288R反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，相應(yīng)引物序列見(jiàn)表2。

表2 構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒引物序列Tab 2 Primers used for retroviral plasmids construction

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒感染MCF7SIRT3KO細(xì)胞系 反轉(zhuǎn)錄病毒感染前24 h，在10 cm培養(yǎng)皿中接種MCF7細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合至60%～70%。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒Gag-pol、pVSV-G和目標(biāo)基因質(zhì)粒在293T細(xì)胞系產(chǎn)生病毒液。用3 mL病毒液、1 mL培養(yǎng)基和8μg/mL的聚凝胺感染MCF7SIRT3KO 細(xì)胞系，通過(guò)嘌呤霉素篩選構(gòu)建空載（Vector）、SIRT3 WT和SIRT3 K288R細(xì)胞系。

1.2.6 細(xì)胞線粒體組分分離 收集1×108個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2遍，用冰浴預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計(jì)數(shù)，剩余細(xì)胞在4 ℃下600×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL 線粒體分離液［210 mmol/L 甘露醇、70 mmol/L 蔗糖、5 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5）、1 mmol/L EGTA、0.5 mg/mL BSA］至細(xì)胞或組織中，輕輕吹打細(xì)胞，冰上放置10～15 min；把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，勻漿30下左右。細(xì)胞勻漿液在4 ℃下600×g離心10 min，沉淀主要為細(xì)胞核組分，小心將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，在4 ℃下3 500×g離心10 min，小心去除上清組分，沉淀即為分離得到的細(xì)胞線粒體。

1.2.7 免疫沉淀實(shí)驗(yàn) 收集1×108個(gè)細(xì)胞的線粒體組分，用PBS 沖洗1～2 遍，加入300 μL 細(xì)胞裂解緩沖液［含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、300 mmol/L NaCl、0.3%NP40 和1%蛋白酶抑制劑］，13 500×g離心后取上清液。取1/10 裂解液作為陽(yáng)性對(duì)照樣本，剩余裂解液加入1 μL相應(yīng)的抗體，在4 ℃下?lián)u床孵育過(guò)夜。將10 μL 蛋白A瓊脂糖純化樹(shù)脂加入上述細(xì)胞裂解液并在4 ℃下?lián)u床孵育2～3 h。在4 ℃下4 500×g離心5 min，將瓊脂糖純化樹(shù)脂離心至管底；將上清液小心吸去，再將瓊脂糖純化樹(shù)脂用裂解緩沖液洗3次。最后，進(jìn)行Western blotting分析。

1.2.8 阿霉素耐藥性實(shí)驗(yàn) 以1×105個(gè)/孔的密度將MCF7細(xì)胞接種到96孔板中，加入含有10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在各孔中分別加入終濃度為10、5、2.5、1.25 μg/mL阿霉素處理24、48、72 h，以未加阿霉素處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，用分光光度儀讀取波長(zhǎng)540 nm 處的吸光度值［D（540 nm）］，通過(guò)公式［細(xì)胞活性=（D樣本/D對(duì)照）×100%］計(jì)算細(xì)胞活性，確定SIRT3 K288R 乳腺癌細(xì)胞在體外對(duì)于化療藥物的敏感性。分別計(jì)算阿霉素在3個(gè)細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立SIRT3 SUMO化修飾位點(diǎn)突變的MCF7細(xì)胞系

為了特異性地研究SIRT3 蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，我們首先構(gòu)建了將SIRT3敲除的MCF7細(xì)胞系。將構(gòu)建好的pX330-sgRNA 轉(zhuǎn)染至MCF7 細(xì)胞，用Western blotting檢測(cè)SIRT3 蛋白條帶，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，并篩選陰性克隆，用未轉(zhuǎn)染的MCF7 細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果（圖1A）可見(jiàn)sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3轉(zhuǎn)染后均無(wú)SIRT3條帶，說(shuō)明SIRT3 無(wú)表達(dá)；故sgRNA1、sgRNA2 和sgRNA3 均成功構(gòu)建出了SIRT3敲除的MCF7 細(xì)胞系，即MCF7-SIRT3KO細(xì)胞，可用于單克隆細(xì)胞培養(yǎng)。

為了進(jìn)一步研究SIRT3 的SUMO 化對(duì)乳腺癌的影響，我們?cè)贛CF7-SIRT3KO 細(xì)胞的基礎(chǔ)上，分別轉(zhuǎn)入SIRT3 WT 質(zhì)粒和SIRT3 K288R 質(zhì)粒。得到SIRT3 WT 和SIRT3 K288R 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，以感染空病毒載體的MCF7-SIRT3KO 細(xì)胞作為對(duì)照（Vector 組）。然后，用免疫共沉淀和Western blotting 鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（圖1B），在Input中，SIRT3 WT 和SIRT3 K288R 可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量28 000的蛋白條帶，而Vector組無(wú)條帶，表明2株細(xì)胞系均成功轉(zhuǎn)入SIRT3 質(zhì)粒。用SIRT3 抗體做免疫沉淀，并用SIRT3和SUMO1 抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示SIRT3 WT 有SUMO 化修飾，即存在一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為47 000 的條帶，而在SIRT3 K288R則沒(méi)有，表明SIRT3 K288R能夠使MCF7細(xì)胞的SIRT3 SUMO 化修飾缺失，可用于研究SIRT3 去SUMO化修飾在乳腺癌細(xì)胞的作用。

圖1 通過(guò)免疫沉淀和Western blotting鑒定構(gòu)建的SIRT3 SUMO位點(diǎn)突變細(xì)胞系Fig 1Confirmation of SIRT3 SUMOylation deficiency cell line by immunoprecipitation and Western blotting

2.2 SIRT3去SUMO化修飾對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

乳腺癌細(xì)胞的增殖對(duì)乳腺癌的惡化、轉(zhuǎn)移及治療耐藥性均有明顯的促進(jìn)作用，控制癌細(xì)胞的增殖已經(jīng)成為遏制腫瘤對(duì)機(jī)體進(jìn)一步侵襲的有效手段。SIRT3的SUMO化修飾能減弱SIRT3 的活性，進(jìn)而降低蛋白質(zhì)的去乙酰化水平［18］，但SIRT3 的SUMO 化修飾是否影響乳腺癌細(xì)胞的增殖并不清楚。我們使用超低吸附6 孔板將Vector、SIRT3 WT和SIRT3 K288R細(xì)胞株培養(yǎng)于無(wú)血清的MEGM培養(yǎng)基中，連續(xù)7 d 每隔24 h 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，以檢測(cè)SIRT3 去SUMO 化修飾對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖速率的影響。結(jié)果（圖2A）顯示，相同培養(yǎng)時(shí)間下，SIRT3 K288R 細(xì)胞株的增殖速率明顯低于SIRT3 WT和Vector 細(xì)胞系，表明SIRT3 不能發(fā)生SUMO 化修飾時(shí)，即SIRT3活性增強(qiáng)時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖速率有抑制作用。

同時(shí)，我們使用超低吸附6 孔板將Vector、SIRT3 WT 和SIRT3 K288R 細(xì)胞株培養(yǎng)于無(wú)血清的MEGM 培養(yǎng)基中（添加B27和EGF）10 d。培養(yǎng)過(guò)程中在顯微鏡下對(duì)非黏附性乳腺球群細(xì)胞測(cè)量直徑大??；發(fā)現(xiàn)SIRT3 K288R細(xì)胞株直徑最?。▓D2B），表明其增殖最緩慢。綜上，我們的研究表明SIRT3 的去SUMO 化修飾對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖有抑制作用。

圖2 3組細(xì)胞的7 d生長(zhǎng)曲線和非黏附性乳腺球群細(xì)胞Fig 2 Seven-day growth curves of cells and non-adherent breast cancer cell clumps in 3 groups

2.3 SIRT3去SUMO化修飾對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響

癌細(xì)胞的耐藥性增強(qiáng)使得癌細(xì)胞能有效逃脫臨床藥物的治療，這使得腫瘤治療面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。阿霉素是一類廣譜抗腫瘤藥物，用于乳腺癌等腫瘤的治療。為了進(jìn)一步研究SIRT3 去SUMO 化修飾對(duì)腫瘤耐藥性的影響，我們對(duì)Vector、SIRT3 WT 和SIRT3 K288R 細(xì)胞系進(jìn)行了阿霉素耐藥性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)分析3株細(xì)胞系在化療藥物處理下的活性差異，我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)24、48 和72 h時(shí)，阿霉素濃度為2.5、5 和10 μg/mL 的條件下，SIRT3 K288R 細(xì)胞株的活性均顯著高于SIRT3 WT 和Vector 細(xì)胞系，表明SIRT3 SUMO 位點(diǎn)突變后，乳腺癌細(xì)胞的耐藥性增強(qiáng)。同時(shí)，隨著阿霉素濃度的增加，SIRT3 K288R細(xì)胞株的活性由低于SIRT3 WT 逐漸轉(zhuǎn)變成高于SIRT3 WT，我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)24、48和72 h時(shí)均觀察到了這種現(xiàn)象（圖3），進(jìn)一步提示SIRT3 SUMO 化能提高乳腺癌細(xì)胞在體外對(duì)于化療藥物的敏感性。

圖3 3種細(xì)胞株經(jīng)不同濃度阿霉素處理24 h（A）、48 h（B）和72 h（C）后的活性比較Fig 3 Cell viability of 3 cell lines treated with various concentrations of ADM for 24 h(A),48 h(B),and 72 h(C)

計(jì)算阿霉素的IC50，其值越高，說(shuō)明細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性越強(qiáng)。阿霉素不同時(shí)間處理下Vector、SIRT3 WT和SIRT3 K288R 細(xì)胞系的IC50見(jiàn)表4，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3 K288R 的IC50在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于Vector 和SIRT3 WT，表明SIRT3 SUMO 化修飾位點(diǎn)突變的MCF7 細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性最強(qiáng)，即SIRT3 去SUMO 化修飾使乳腺癌細(xì)胞系的耐藥性增強(qiáng)。

表3 阿霉素處理3種細(xì)胞不同時(shí)間的IC5（0μg·mL-1）Tab 3 IC50 of ADM in 3 cell lines for different time（μg·mL-1）

3 討論

根據(jù)Warburg效應(yīng)，即使在有氧的情況下，腫瘤細(xì)胞仍然優(yōu)先地利用葡萄糖進(jìn)行糖酵解從而獲取能量［27］。脂肪酸合成及氧化代謝活躍是惡性腫瘤普遍具有的特異性之一［28］。而去乙?；窼IRT3 促進(jìn)氧化磷酸化和脂肪酸氧化的代謝，從而能夠降低糖酵解水平，起到抑制腫瘤增殖的作用。SIRT3 的SUMO 化修飾能夠抑制其活性，去SUMO 化修飾可增強(qiáng)其活性，因此SIRT3 去SUMO 化修飾后具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的潛質(zhì)。

SUMO 化修飾在乳腺癌中扮演著重要的角色，它可以控制乳腺癌細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)變［29］，還能調(diào)控細(xì)胞有絲分裂中紡錘體的功能進(jìn)而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［30］。也有報(bào)道，SUMO 化修飾的乳腺癌1 號(hào)基因編碼蛋白（breast cancer suppressor protein，BRCA1）調(diào)控DNA 損傷反應(yīng)，而B(niǎo)RCA1的突變與高風(fēng)險(xiǎn)的乳腺癌有極大的相關(guān)性［31］。對(duì)癌癥中SUMO 化修飾作用的研究將成為癌癥治療的新方向。雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性乳腺癌患者的ROS 明顯高于ER 陰性患者，并且在ER陽(yáng)性患者中，ROS 與腫瘤大小和組織轉(zhuǎn)移相關(guān)［32］，因此我們選擇ER 陽(yáng)性的MCF7 細(xì)胞系作為研究對(duì)象，探索SIRT3 去SUMO 化修飾對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和耐藥性的影響。為了研究SIRT3 去SUMO 化修飾對(duì)乳腺癌的影響，我們?cè)赟IRT3KO MCF7 細(xì)胞的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了SIRT3 WT和SIRT3 K288R 的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。我們發(fā)現(xiàn)在SIRT3 的SUMO 化修飾位點(diǎn)突變的乳腺癌細(xì)胞增殖受到了抑制，這與已報(bào)道的SIRT3 SUMO 化修飾位點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)氧化磷酸化和脂肪酸氧化代謝，糖酵解受抑是能夠相互印證的。

在正常細(xì)胞中，SIRT3維持線粒體代謝、增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)細(xì)胞免受自身凋亡。而在腫瘤細(xì)胞中，SIRT3能通過(guò)產(chǎn)生較低水平的ROS，減少細(xì)胞凋亡和自噬，提高細(xì)胞活性，從而能夠抵抗化療誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，使其獲得較高的細(xì)胞存活率。有研究表明，通過(guò)特異siRNA沉默SIRT3在MCF7 和T47D 細(xì)胞系中的表達(dá)，能夠增加化療藥物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，患者的生存曲線也顯示高SIRT3 表達(dá)的乳腺癌預(yù)后較差［11］。通過(guò)對(duì)SIRT3 WT 和SIRT3 K288R細(xì)胞株給予不同濃度的阿霉素，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3 K288R細(xì)胞株均比SIRT3 WT 細(xì)胞株耐藥，而隨著阿霉素處理濃度的逐漸增加，SIRT3 WT 的活性由明顯高于SIRT3 K288R轉(zhuǎn)變成明顯低于SIRT3 K288R，表明SIRT3 K288R的耐藥性高于SIRT3 WT。SIRT3 SUMO 化位點(diǎn)突變性細(xì)胞系與野生型對(duì)比，在使用不同濃度的阿霉素處理不同的時(shí)間后，SIRT3 K288R 的IC50在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（24 h、48 h 和72 h）均高于Vector 和SIRT3 WT，進(jìn)一步證明SIRT3 的去SUMO 化修飾能夠顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性。這些結(jié)果都表明，SIRT3 的SUMO 化修飾能夠改變腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝狀態(tài)。該結(jié)論可為治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)提供更多的理論方向。