肝細胞癌中ATP1B3基因表達及功能的生物信息學分析

呂學寧，葉必成，王昌成

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前全球癌癥死亡的第2大主要原因[1]，具有較高的病死率[2]，大多數(shù)肝癌病人診斷時間較晚，總體治療效果相對較差[3-4]，其5年生存率約為18%[5]。 肝細胞癌遺傳異質性較強，疾病的發(fā)生發(fā)展中涉及眾多基因的改變及相互作用，因此極易復發(fā)及轉移。雖然針對癌基因突變的不同靶點，進行靶向干預治療，為肝細胞癌治療開辟了新的思路，但目前對肝細胞癌的確切分子機制仍尚不清楚[6]，有必要繼續(xù)積極探索HCC分子機制以及起關鍵作用的致癌基因為肝細胞癌的診治提供參考。

ATP1B3（ATPase Na+/K+Transporting Subunit Beta 3）是Na+/K+-ATP酶編碼的β3亞基，是ATP酶的一個分子調節(jié)亞基，定位于Chr 3號染色體q22-23區(qū)域[7]，Na+/K+-ATP酶廣泛分布在原核和真核細胞中，參與多種細胞活動：維持跨膜細胞離子平衡、在細胞質中建立高K+低Na+調節(jié)跨膜電位、維持細胞環(huán)境穩(wěn)定等。Na+/K+-ATP酶不僅參與正常的細胞活動，而且在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，是腫瘤治療的潛在靶點[8]。相關研究表明，ATP1B3可上調淋巴細胞活性，促進 IFN-t、IL-2、IL-4和 IL-10的產生[9-10]，以及作用于細胞周期抑制癌細胞的凋亡[11]等來促進腫瘤的發(fā)展，本研究自2020年5―8月通過不同數(shù)據(jù)庫探討ATP1B3基因在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 ATP1B3在不同人類腫瘤中的表達水平通過 Oncomine（https：//www.oncomine.org/）及 TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）數(shù)據(jù)庫進行ATP1B3 mRNA表達水平的分析，探索ATP1B3在不同腫瘤中的表達差異性（以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義）。

1.2 ATP1B3在肝細胞癌的表達情況利用Oncomine數(shù)據(jù)庫及HCCDB數(shù)據(jù)庫（http：//lifeome.net/database/hccdb/home.html），通過多個肝癌數(shù)據(jù)集檢測ATP1B3 mRNA在肝細胞癌組織中的表達水平。采用R軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間ATP1B3的表達數(shù)據(jù)，采用成組t檢驗，臨界值設定條件（P<0.05）。

1.3 臨床病理特征分析在TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫下載LIHC的FPKM數(shù)據(jù)，使用R軟件進行統(tǒng)計分析及數(shù)據(jù)可視化，分析ATP1B3 mRNA表達量與各個臨床病理特征之間的關系，包括：腫瘤分級、分期、性別、年齡、BMI、家族史、血管浸潤及癌組織周圍炎癥等。各個基因表達量為log2（FPKM+1），并排除了臨床信息不完整的樣本。組間比較分別采用成組t檢驗，多組間（≥3）采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 生存分析通過Kaplan-Meier plotter（KMPLOT）（http：//kmplot.com/analysis/）在線工具對ATP1B3在肝細胞癌中的預后進行生存分析評估，包括：總生存期（overall survival，OS）、無復發(fā)生存期（recurrence free survival，RFS）、無進展生存期（progression free survival，PFS）和疾病特異性生存期（disease free survival，DSS）。并對肝細胞癌病人進行了亞組生存分析，包括：性別、分期、分級、人種、有無飲酒史及有無肝炎病毒感染。此外，排除臨床信息不完整的樣本，利用R軟件構建多因素Cox回歸模型評估影響肝細胞癌病人總體生存期的危險因素。生存分析采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗，計算95%置信區(qū)間（95%CI）和風險比（HR），P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 GSEA富集分析使用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探討ATP1B3可能通過哪些生物過程參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。利用R軟件通過Spearman檢驗將肝細胞癌的FPKM數(shù)據(jù)分成ATP1B3的正相關組（cor>0）和負相關組（cor<0），按照相關系數(shù)大小進行基因排序，并通過使用R軟件的clusterProfiler包對兩組進行富集分析，其中錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 免疫浸潤相關性分析通過TIMER數(shù)據(jù)庫，評估ATP1B3表達與免疫浸潤水平的相關性，包括腫瘤純度、B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞浸潤水平（cor<0為負相關，cor>0為正相關，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義）。此外，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了正常肝組織及肝細胞癌中的不同免疫細胞的免疫標記集與ATP1B3的相關性（cor<0為負相關，cor>0為正相關，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義）。

1.7 ATP1B3靶向藥物富集分析利用GeneMANIA（https：//genemania.org/）建立以ATP1B3為核心的基因網(wǎng)絡，并且通過使用WebGestalt（http：//www.webgestalt.org/）對以ATP1B3為核心的基因網(wǎng)絡進行了靶向藥物的富集分析，預測通過該基因網(wǎng)絡中相關通路作用于ATP1B3的靶向藥物。

1.8 統(tǒng)計學方法采用R軟件對進行數(shù)據(jù)分析。差異分析中對于兩組ATP1B3 mRNA的表達數(shù)據(jù)，采用成組t檢驗，對于兩組以上的數(shù)據(jù)，采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。生存分析采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗，包括多因素Cox回歸模型評估影響肝細胞癌病人總體生存期的危險因素，計算95%置信區(qū)間（95%CI）和風險比（HR），其中P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。富集分析，以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。免疫浸潤相關性分析，以cor<0為負相關，cor>0為正相關，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ATP1B3在不同人類腫瘤中的表達差異性為了確定ATP1B3在不同腫瘤和正常組織中的表達差異，我們使用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析了不同腫瘤組織和正常組織中ATP1B3 mRNA的表達水平。該分析顯示，與正常組織相比，ATP1B3在大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤（brain and CNS cancer）、食管癌（esophageal cancer）、胃癌（gastric cancer）、頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck cancer）、腎癌（kidney cancer）、白血?。╨eukemia）、肝癌（liver cancer）、淋巴瘤（lymphoma）及肉瘤（sarcoma）等腫瘤中的表達升高；此外，還有部分數(shù)據(jù)顯示ATP1B3在結直腸癌（colorectal cancer）、肺癌（lung cancer）和前列腺癌（prostate cancer）中表達降低。

為了進一步評估ATP1B3在不同腫瘤中的表達情況，我們利用TIMER數(shù)據(jù)庫中多個惡性腫瘤的數(shù)據(jù)檢測ATP1B3的表達。分析顯示：在乳腺癌（breast cancer，BRCA）、膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、肝細胞癌（liver heaptocellular carcinoma，LIHC）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、胃癌（stomach adenocarcinoma，STAD）、甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）和子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）中，ATP1B3 mRNA表達量顯著高于正常組織；在結腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）、腎嫌色細胞癌（kidney chromophobe，KICH）、腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）及直腸腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）中ATP1B3 mRNA表達量顯著低于正常組織。這些結果表明ATP1B3在許多腫瘤中均具有顯著差異性表達，可能是部分腫瘤的潛在癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的價值。

2.2 ATP1B3 mRNA在肝細胞癌中的表達在HCCDB數(shù)據(jù)庫中分析了9個肝細胞癌的基因集：BCCDB4（P<0.001）、BCCDB6（P<0.001）、HCCDB12（P<0.001）、HCCDB13（P<0.001）、HCCDB15（P<0.001）、HCCDB16（P<0.001）、HCCDB17（P<0.001）、HCCDB18（P<0.001），研究發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常組織相比，HCC中ATP1B3 mRNA表達升高。Oncomine數(shù)據(jù)庫中的三個基因集的ATP1B3 mRNA表達也得出相似的結果：Mas Liver（P<0.001）、Chen Liver（P<0.001）、Rossler Liver（P<0.001）。此外，肝硬化中ATP1B3 mRNA水平顯著高于正常組織（P<0.001）。因此，這些結果表明ATP1B3可能是肝細胞癌中潛在的生物學標志物，甚至可能是肝硬化發(fā)展為肝細胞癌的始動因素。

2.3 ATP1B3的表達在不同臨床病理特征中的差異分析在TCGA數(shù)據(jù)庫下載肝細胞癌的FPKM數(shù)據(jù)，分析ATP1B3的表達與各個臨床病理特征之間的關系，研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌的分化程度越低，ATP1B3的表達越高，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（F=6.513，P<0.001）；且肝細胞癌分期越高，ATP1B3的表達越高，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（F=4.341，P=0.015），這一結果提示ATP1B3可能通過某種途徑來影響肝細胞癌的進展。此外，ATP1B3在不同性別（t=?1.406，P=0.162）、不同年齡（F=1.315，P=0.272）、有無家族史（t=?0.076，P=0.939）、BMI（F=0.985，P=0.376）、有無血管浸潤（t=1.429，P=0.155）、及癌組織周圍有無炎癥（t=0.996，P=0.321）中的表達差異無統(tǒng)計學意義。綜上，這些結果證明ATP1B3可能是肝細胞癌診斷的標志物。

2.4 ATP1B3高表達對肝細胞癌病人預后的影響為了進一步評估ATP1B3基因在肝細胞癌中的預后價值，我們使用了KMPLOT這一在線工具對TCGA數(shù)據(jù)的370例肝細胞病人進行生存分析。這些結果表明，在ATP1B3高表達組中，肝細胞癌病人的OS（總生存期）[HR=1.89（1.15～3.11），P=0.011]和DSS（疾病特異性生存期）[HR=1.97（1.11～3.48），P=0.018]相對于ATP1B3低表達組顯著減少；PFS（無進展生存期）[HR=1.49（0.91～2.43），P=0.110]和RFS（無復發(fā)存期）[HR=1.54（0.92～2.58），P=0.100]差異無統(tǒng)計學意義。此外，我們對371例肝細胞癌病人進行了亞組生存分析，分析發(fā)現(xiàn)（表1）：所有女性病人中的ATP1B3高表達組具有較差的OS和PFS；所有男性病人中的ATP1B3高表達組具有較差的OS；1期肝細胞癌病人中ATP1B3高表達組具有較差的 OS和 PFS，1+2期、3期、3+4期病人中ATP1B3高表達組具有較差的OS；2級肝細胞癌病人中ATP1B3高表達組具有較差的OS和PFS，3級肝細胞癌病人中ATP1B3高表達組具有較差的OS；白種人群的肝細胞癌病人中ATP1B3高表達組具有較差的PFS，亞洲人群的肝細胞癌病人中ATP1B3高表達組具有較差的OS和PFS；無飲酒史的肝細胞癌病人中ATP1B3高表達組具有較差的OS；感染及未感染肝炎病毒的肝細胞癌病人中ATP1B3高表達組均具有較差的OS。因此ATP1B3高表達的肝細胞癌病人具有相對較差的預后。而多因素COX回歸分析提示ATP1B3高表達是影響肝細胞癌病人總體生存預后的獨立危險因素（P=0.005）。這些結果都顯著表明ATP1B3是肝細胞癌病人的潛在預后指標。

表1 在不同臨床特征的肝細胞癌中ATP1B3高表達的預后分析

2.5 ATP1B3表達的生物學功能分析為了進一步探索ATP1B3在肝細胞癌的潛在生物學功能，我們對ATP1B3基因正負相關的兩組進行富集分析。正相關組主要富集核糖體、剪接體、趨化因子信號通路、RNA轉運、Rap1信號通路、MAPK信號通路及Ras信號通路等，這一結果表明ATP1B3的高表達可能激活這些通路，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，負相關組富集于酮體的合成與降解等的代謝，這一結果表明ATP1B3的高表達可能抑制這一通路。

2.6 肝細胞癌中ATP1B3的表達與免疫浸潤水平相關性分析通過TIMER數(shù)據(jù)庫，我們評估了ATP1B3表達與免疫浸潤水平的相關性，研究發(fā)現(xiàn)：ATP1B3表達與肝細胞癌的腫瘤純度呈負相關（cor=?0.29，P<0.001）；與 B 細胞（cor=0.34，P<0.001）、CD8+T細胞（cor=0.30，P<0.001）、CD4+T細胞（cor=0.32，P<0.001）、巨噬細胞（cor=0.49，P<0.001）、中性粒細胞（cor=0.44，P<0.001）及樹突狀細胞（cor=0.44，P<0.001）浸潤水平呈正相關。

為了進一步研究不同免疫浸潤細胞與ATP1B3的關系，本文還研究了GEPIA數(shù)據(jù)庫中正常肝組織和肝細胞癌中的不同免疫細胞的免疫標記集與ATP1B3的關系，結果顯示，與正常肝組織相比，在肝細胞癌中，ATP1B3表達水平與部分免疫細胞的免疫標記集顯著相關（cor>0，P<0.05），這些結果提示ATP1B3表達可能與腫瘤的部分免疫細胞浸潤有關，通過免疫浸潤進一步促進腫瘤的進展。

2.7 ATP1B3的基因網(wǎng)絡分析通過GeneMAINA在線數(shù)據(jù)庫以ATP1B3為核心的基因網(wǎng)絡，通過WebGestalt數(shù)據(jù)庫分析這一基因網(wǎng)絡，我們發(fā)現(xiàn)強心苷類藥物可能通過該網(wǎng)絡的潛在通路作用于ATP1B3，是抗肝細胞癌ATP1B3的基因靶向藥物。

3 討論

肝細胞癌是我國常見的惡性腫瘤之一，隨診醫(yī)療技術水平的不斷發(fā)展，腫瘤分子生物學研究的不斷深入，肝細胞癌的靶向治療正在快速發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)的常見突變基因包括 TERT、MLL4、CCNE1[12]、TP53和CTNNB1等[13-14]。盡管有許多潛在的治療靶點，但肝細胞癌病人發(fā)病率和病死率仍在升高[15]，總體生存率仍然不理想，因此繼續(xù)探究肝細胞癌的潛在分子機制及癌變基因為肝細胞癌的診治提供新思路至關重要。本研究通過生物信息學公開數(shù)據(jù)分析，首次探討了ATP1B3在肝細胞癌中的作用，進一步了解了ATP1B3在肝細胞癌中的潛在價值。

Na+/K+-ATP酶是一種跨膜轉運蛋白，主要調節(jié)細胞內外Na+、K+的平衡，維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定，對細胞的生長、分化和存活起到至關重要的作用[16]，Na+/K+-ATP酶不僅參與正常的細胞活動，而且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，目前已有研究將其作為治療乳腺癌的靶點[17]。而Na+/K+-ATP酶由3個亞基組成：α、β和FXYD家族的成員[18]，α亞基是催化亞基，而β亞基和FXYD是調節(jié)亞基，每個亞基的已知亞型包括：α1-α4，β1-β3，以及 FXYD1-FXYD7[19]，其中β亞基的三個亞型β1、β2和β3，參與全酶的結構和功能成熟[20-22]。相關研究指出Na+/K+-ATP 酶亞基在胃癌[23]、膀胱癌[24]和乳腺癌[25]中表達均升高。Mijatovic研究指出Na+/K+-ATP酶α1亞基的下調降低了非小細胞肺癌（NSCLC）細胞的遷移和增殖[26]。Li等[11]相關研究結果指出，ATP1B3在胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，ATP1B3高表達在胃組織中具有致癌作用。但是劉戰(zhàn)培研究表明增加ATP1B3在腫瘤細胞中的表達能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長，甚至使其變性死亡[27]。此外，ATP1B3還在免疫應答中具有調節(jié)作用[10]，研究表明Na+/K+-ATP酶的α或β亞基參與 HIV-1[28]、腸病毒 71[29]、冠狀病毒[30]、IAV/IBV[31]和 HCMV 感染[32]。Baisong Zheng等[33]研究指出過表達ATP1B3降低了乙型病毒性肝炎中HBsAg和HBeAg的數(shù)量，因此ATP1B3在抗病毒免疫應答中也起到重要作用。

本研究利用不同數(shù)據(jù)庫分析了ATP1B3在肝細胞癌中的表達，研究得出ATP1B3在肝細胞癌中具有顯著的表達差異性，且可能參與腫瘤的浸潤發(fā)展，而與性別、年齡、家族史、BMI、血管浸潤及癌組織周圍炎癥均無明顯關系，因此表明ATP1B3可以作為肝細胞癌診斷的潛在標志物。并且ATP1B3的過表達導致肝細胞癌病人預后較差，是預測肝細胞癌病人總生存期的獨立危險因素，這一結果表明ATP1B3是肝細胞癌病人的潛在預后指標。

此外，本研究通過富集分析富集出ATP1B3基因高表達的樣本存在于核糖體、剪接體、趨化因子信號通路、RNA轉運、Rap1信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路及PI3K/AKT通路等生物過程從而促進腫瘤的進展。大量研究表明Rap1在多種癌癥中激活，包括白血病和實體瘤，如：前列腺癌、黑色素瘤、結腸癌、胰腺癌及人類口腔癌等等[34]。Ras蛋白在許多腫瘤的發(fā)生和維持中發(fā)揮關鍵作用，Ras是肺癌、結腸癌、胰腺癌等癌癥疾病常見的致癌基因[34]，在肝細胞癌中ATP1B3可能通過某些機制作用于Rap1、Ras信號通路，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。異常的MAPK信號在人類癌癥的發(fā)展和進展中起著關鍵的作用，也決定了對癌癥治療的反應，應激激活的MAPKs（包括JNK和p38）與多種惡性腫瘤有關，包括濾泡性淋巴瘤、肺、甲狀腺和乳腺癌、膠質瘤和頭頸部鱗狀細胞癌等等[35]。并且MAPK信號通路還與腫瘤浸潤和轉移相關，劉紅兵[36]相關文獻指出MAPK通路在胃癌的浸潤和轉移過程中具有重要的作用，本文得出ATP1B3可能通過AMPK信號通路作用于肝細胞癌，并且浸潤相關分析得出ATP1B3參與肝細胞癌的免疫浸潤，通常免疫細胞的浸潤豐度越高，提示免疫基因的異常表達越高，腫瘤免疫微環(huán)境越紊亂，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移的進程。此外相關文獻還指出ATP1B3可上調淋巴細胞活性，促進 IFN-t、IL-2、IL-4和 IL-10的產生[9-10]，因此，ATP1B3可能通過AMPK 信號通路、上調淋巴細胞活性及免疫浸潤等過程共同促進肝細胞癌的浸潤轉移。

本研究還通過GeneMAINA在線數(shù)據(jù)庫以ATP1B3為核心的基因網(wǎng)絡，通過WebGestalt數(shù)據(jù)庫分析這一基因網(wǎng)絡，我們發(fā)現(xiàn)強心苷類藥物可能通過該網(wǎng)絡的潛在通路作用于ATP1B3，是抗肝細胞癌ATP1B3基因的靶向藥物。既往研究表明強心苷類藥物，包括地高辛、蛙巴因、阿諾布費金和蟾毒靈等，是Na+/K+-ATP酶抑制劑，通過特異性地結合Na+/K+-ATP酶的α亞基，調節(jié)細胞內不同信號通路，如激活NF-κB，激活Ras/Raf/MEK/ERK蛋白級聯(lián)反映，增加P53及減少Cyclin D表達等，最終對腫瘤細胞產生抑制作用[37-38]。還有研究表明強心苷在非小細胞肺癌[39]、肝癌[40]、胰腺癌[41]、乳腺癌[42]、白血病[43]、食管癌[44]等腫瘤中均被證實可以抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。本研究結果表明強心苷類藥物可能通過抑制ATP1B3的表達來抑制肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，但其分子機制尚不清楚，有待基礎及臨床試驗進一步驗證。

綜上所述，本研究運用相關生物信息學方法揭示了ATP1B3可能是肝細胞癌潛在的致癌基因，其表達上調在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要作用，并可能成為判斷肝細胞癌病人預后的重要的生物學指標，為肝細胞癌的診斷及治療提供參考。