泛素羧基末端水解酶L1、膠質(zhì)纖維酸性蛋白水平對新生兒窒息腦損傷的診斷價值

鄭小冬，祝毓斌，林魯飛，蔡文燕，吳岳彪

新生兒窒息是一種由各種原因所致母體-胎兒間通過胎盤血流進(jìn)行氣體交換發(fā)生急性障礙時，胎兒出現(xiàn)嚴(yán)重缺氧和酸中毒及呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制，致使胎兒出生后不能正常呼吸的兒科臨床危重疾病[1]。近年研究表明，中國新生兒窒息發(fā)病率呈較高水平[2]。腦損傷指產(chǎn)前、產(chǎn)時、出生后各種病理因素所引起的不同程度的腦缺血或出血性損害，新生兒窒息后主要并發(fā)癥之一，腦損傷嚴(yán)重時會引發(fā)腦癱等后遺癥，影響新生兒生命健康。目前國內(nèi)外對新生兒窒息后腦損傷相關(guān)研究已有較多，但對其早期診斷方面研究仍有不足。因此繼續(xù)探尋新生兒窒息后腦損傷診斷因子，對及時發(fā)現(xiàn)并治療新生兒窒息后腦損傷有重要意義。程啟慧等研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血性腦卒中患者血清泛素羧基末端水解酶L 1（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L 1，UCH-L 1）水平顯著升高，與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)[3]。祝善堯等[4]研究報道，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）在嬰兒痙攣癥病兒血清和腦脊液中高表達(dá)，有助于判斷病兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損程度。有研究表明，UCH-L 1和GFAP聯(lián)合檢測可用于評估心臟驟停病兒腦損傷水平[5]。由于UCH-L 1和GFAP在新生兒窒息后腦損傷中聯(lián)合探究鮮有報道，本研究通過檢測新生兒窒息后腦損傷病兒血清UCH-L 1、GFAP表達(dá)水平，分析二者與疾病進(jìn)展關(guān)系及對疾病診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月至2019年5月海口市第四人民醫(yī)院收治的窒息新生兒126例，病兒日齡1～5 d。根據(jù)Apgar評分[6]標(biāo)準(zhǔn)將入組病兒分為重度窒息組57例，其中男30例，女27例，1 min Apgar評分為0～3分；輕度窒息組69例，男38例，女31例，1 min Apgar評分為4～7分。另根據(jù)病兒出生后1～5 d顱腦B超、CT或核磁共振掃描結(jié)果（是否患有缺血缺氧性腦病[6]），將入組病兒分為腦損傷組（77例）和無腦損傷組（49例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合新生兒窒息診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；（2）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）早產(chǎn)兒；（2）合并患有感染性、先天性代謝類疾?。唬?）合并患有黃疸、溶血性疾病；（4）母體孕期患有妊娠期高血壓疾病。另選取同期在?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院出生的健康新生兒123例為對照組，健康新生兒日齡1～5 d。本研究中所有受試新生兒近親屬對本研究知情并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要儀器和試劑多功能酶標(biāo)儀（型號Multiskan MK3，美國Thermo公司）、UCH-L 1酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號JL19379，上海江萊生物科技有限公司）、GFAP ELISA試劑盒（貨號JL023505，上海江萊生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及一般資料收集 受試窒息新生兒及健康新生兒均于入組后第2天清晨（7：00～9：00）收集外周靜脈血2 mL。4℃、3 000 r/min離心20 min后，于?80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

入組時收集新生兒性別、胎齡、日齡、出生時體重等一般資料，并于出生后14 d時對窒息新生兒進(jìn)行新生兒神經(jīng)行為評估（neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）評分[8]測定。NBNA 評分總分為40分，<37分為異常。

1.3.2 血清UCH-L 1、GFAP水平測定 采用ELISA法測定所有受試新生兒血清UCH-L 1、GFAP水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 21.0對本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，總體有差異者再進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例（%）表示，用χ2檢驗(yàn)。Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，logistic回歸模型分析進(jìn)行危險因素分析，ROC曲線進(jìn)行診斷價值分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重度窒息組、輕度窒息組及對照組一般資料比較重度窒息組、輕度窒息組及對照組性別、胎齡、平均日齡、出生時體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。重度窒息組病兒1 min Apgar評分明顯低于輕度窒息組和對照組（P<0.05），輕度窒息組1 min Apgar評分明顯低于對照組（P<0.05）。重度窒息組NBNA評分明顯低于輕度窒息組（P<0.05）。見表1。

表1 窒息新生兒126例重度窒息組、輕度窒息組及對照組一般資料比較

2.2 重度窒息組、輕度窒息組及對照組血清UCHL 1、GFAP水平比較重度窒息組血清UCH-L 1、GFAP水平均明顯高于輕度窒息組和對照組（P<0.05），輕度窒息組血清UCH-L 1、GFAP水平均明顯高于對照組（P<0.05）。見表2。

表2 窒息新生兒126例重度窒息組、輕度窒息組及對照組血清UCH-L 1、GFAP水平比較/（ng/mL，±s）

表2 窒息新生兒126例重度窒息組、輕度窒息組及對照組血清UCH-L 1、GFAP水平比較/（ng/mL，±s）

注：UCH-L 1為泛素羧基末端水解酶L 1，GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白。①與對照組比較，P<0.05。②與輕度窒息組比較，P<0.05。

例數(shù)123 69 57 UCH-L 1 0.78±0.25 1.36±0.42①2.19±0.71①②201.30 0.000組別對照組輕度窒息組重度窒息組F值P值GFAP 0.48±0.16 1.14±0.28①1.65±0.49①②322.90 0.000

2.3 腦損傷和無腦損傷組病兒血清UCH-L 1、GFAP水平比較腦損傷組血清UCH-L 1、GFAP水平明顯高于無腦損傷組（P<0.05），腦損傷組NBNA評分明顯低于無腦損傷組（P<0.05）。見表3。

表3 腦損傷和無腦損傷組病兒血清UCH-L 1、GFAP水平比較/±s

表3 腦損傷和無腦損傷組病兒血清UCH-L 1、GFAP水平比較/±s

注：UCH-L 1為泛素羧基末端水解酶L1，GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白，NBNA為神經(jīng)行為評估。

例數(shù)49 77 UCH-L 1/（ng/mL）0.57±0.18 2.31±0.60 19.72 0.000組別無腦損傷組腦損傷組t值P值GFAP/（ng/mL）0.39±0.12 1.76±0.43 21.74 0.000 NBNA評分/分37.24±2.18 31.62±3.11 11.03 0.000

2.4 窒息后腦損傷病兒血清UCH-L 1、GFAP水平與NBNA評分相關(guān)性窒息后腦損傷病兒血清UCH-L 1、GFAP水平均與NBNA評分呈負(fù)相關(guān)（r=?0.471，P=0.000；r=?0.415，P=0.000），見圖1，2。

圖2 窒息后腦損傷病兒血清GFAP水平與NBNA評分相關(guān)性

2.5 新生兒窒息后腦損傷危險因素分析以本研究資料為樣本，以新生兒窒息后是否發(fā)生腦損傷為應(yīng)變量建立Logistic回歸模型，將1 min Apgar評分、NBNA評分、UCH-L 1水平、GFAP水平轉(zhuǎn)化為二分類變量后為自變量納入Logistic回歸模型，選擇逐步向后法、行LR檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，低1 min Apgar評分、低NBNA評分、高UCH-L 1水平、高GFAP水平是影響新生兒窒息后腦損傷發(fā)生的獨(dú)立危險因素（P<0.05）。

2.6 血清UCH-L 1、GFAP對新生兒窒息后腦損傷診斷價值由圖3分析可知，血清UCH-L 1預(yù)測新生兒窒息后腦損傷的曲線下面積為0.802，閾值為1.35，靈敏度為83.10%，特異度為82.00%。血清GFAP預(yù)測新生兒窒息后腦損傷的曲線下面積為0.829，閾值為1.12，靈敏度為84.40%，特異度為76.00%。兩者聯(lián)合預(yù)測新生兒窒息后腦損傷的曲線下面積為0.876，靈敏度為89.60%，特異度為88.00%。

圖3 血清UCH-L 1、GFAP水平對新生兒窒息后腦損傷診斷效能ROC曲線圖

3 討論

窒息新生兒娩出時出現(xiàn)全身皮膚青紫或蒼白、呼吸淺表、肌肉張力松弛等癥狀，可能引起腦損傷等并發(fā)癥，出現(xiàn)智力低下、肢體抽搐、語言功能障礙、聽覺障礙等，給家庭和社會帶來嚴(yán)重精神和經(jīng)濟(jì)方面壓力[9]。早期診斷有助于病情及早發(fā)現(xiàn)和控制。本研究結(jié)果顯示，重度窒息組病兒NBNA評分明顯低于輕度窒息組病兒，提示窒息新生兒腦損傷程度隨窒息程度增大而加重。

泛素羧基末端水解酶（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase，UCH）與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程有關(guān)。UCH-L 1屬于UCH家族成員，具有去泛素化、抑制泛素連接酶活性、穩(wěn)定泛素單體等作用，可參與細(xì)胞增殖、周期、分化、凋亡等過程，與機(jī)體炎癥、免疫、損傷修復(fù)等調(diào)控有關(guān)[10]，在腦中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)中分布廣泛。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，UCHL 1可能作為外傷性腦損傷標(biāo)志物，用于預(yù)測患者患病嚴(yán)重程度及預(yù)后。有研究證實(shí)，新生兒缺氧缺血性腦病病兒出生后24 h血漿中UCH-L 1表達(dá)水平升高，與病兒腦損傷加重有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，重度窒息組病兒血清UCH-L 1水平均明顯高于輕度窒息組病兒和對照組，輕度窒息組病兒血清UCH-L 1水平均明顯高于對照組。且腦損傷組病兒血清UCH-L 1水平明顯升高，與NBNA評分呈負(fù)相關(guān)。與Massaro等[12]研究結(jié)果相似，提示血清UCH-L 1水平升高可能與新生兒窒息后腦損傷發(fā)生及嚴(yán)重程度有關(guān)。Li等[13]研究報道，農(nóng)藥中毒后病人血清UCH-L 1升高，檢測血清UCH-L 1濃度有助于預(yù)測農(nóng)藥中毒后認(rèn)知功能障礙發(fā)生。Carlos等[14]研究發(fā)現(xiàn)，促炎因子IL-1β可能通過介導(dǎo)UCH-L 1參與的泛素化過程，影響阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展。提示本研究中新生兒窒息后腦損傷時可能增加腦組織炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元釋放UCH-L 1進(jìn)入血液，影響病兒血清UCH-L 1水平升高。

GFAP是一種主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的Ⅲ型中間絲狀蛋白，對神經(jīng)和星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)功能維持有重要作用。有研究報道，阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織中GFAP表達(dá)水平上調(diào)，與神經(jīng)功能發(fā)生障礙后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活性提高及增殖有關(guān)[15]。錢紅等[16]研究證實(shí)，腦出血后腦損傷大鼠腦組織中GFAP表達(dá)水平升高，降低GFAP表達(dá)可減輕腦損傷。本研究結(jié)果顯示，對照組、輕度窒息組、重度窒息組血清GFAP水平依次顯著升高，且腦損傷組病兒血清GFAP水平明顯高于無腦損傷組病兒，與NBNA評分呈負(fù)相關(guān)，提示GFAP水平異常升高可能與新生兒窒息后腦損傷發(fā)生發(fā)展有關(guān)。沈露等[17]研究發(fā)現(xiàn)，癲癇部分性發(fā)作患者血清GFAP水平明顯高于對照組，GFAP水平下調(diào)預(yù)示患者病情好轉(zhuǎn)。Shu等[18]研究表明，腦膜腦脊髓炎患者腦組織中GFAP高表達(dá)，與細(xì)胞炎性反應(yīng)增加有關(guān)。GFAP與膠質(zhì)細(xì)胞活性和遷移能力密切相關(guān)，F(xiàn)eng等[19]研究表明，視網(wǎng)膜受損時GFAP水平上調(diào)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子IL-1β介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)。提示本研究中GFAP可能通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、促進(jìn)腦組織中炎癥反應(yīng)發(fā)生，參與新生兒窒息后腦損傷進(jìn)展。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低1 min Apgar評分、低NBNA評分、高UCH-L 1水平、高GFAP水平是影響新生兒窒息后腦損傷發(fā)生的獨(dú)立危險因素。UCH-L 1與GFAP聯(lián)合預(yù)測新生兒窒息后腦損傷的曲線下面積為0.876，靈敏度為89.60，特異度為88.00%。二者聯(lián)合診斷價值較高，可能作為預(yù)測新生兒窒息后腦損傷發(fā)生的生物標(biāo)志物。

綜上所述，窒息新生兒血清UCH-L 1、GFAP水平顯著升高，與窒息程度及腦損傷發(fā)生有關(guān)。血清UCH-L 1、GFAP可作為生物標(biāo)志物，對新生兒窒息后腦損傷有一定診斷價值。但由于本研究樣本量有限，因子具體作用機(jī)制還需增大樣本量全面深入研究。