微小RNA-20a、微小RNA-92a在乳腺癌診斷及預(yù)后評估中的應(yīng)用

羅思佳，袁野，張建新，金煒東

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一。在我國，乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，并且呈現(xiàn)年輕化現(xiàn)象，嚴(yán)重威脅女性生命健康。由于乳腺癌的早期癥狀不明顯，容易出現(xiàn)漏診或誤診，確診時(shí)往往處于中晚期[1]，因此，對乳腺癌病人的早期診斷以及尋找新型的非侵入性分子標(biāo)志物監(jiān)測乳腺癌病情變化及判斷預(yù)后意義深遠(yuǎn)。微小RNA（miRNA）是一類非編碼小分子RNA，研究發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤中具有類似癌基因或抑癌基因的作用，且在疾病過程中的不同時(shí)期血清樣本獲取簡單[2]，因此，血清miRNA作為腫瘤無創(chuàng)診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物的研究是一個(gè)重要的研究方向。miR-20a和miR-92a均是miR-17-92基因簇中的重要成員。目前，研究者們已在胃癌、膀胱癌和宮頸癌等多種腫瘤病人血清中發(fā)現(xiàn)miR-20a和miR-92a表達(dá)異常，且其與腫瘤的分化程度、預(yù)后等密切相關(guān)[3-5]。但二者在乳腺癌中的表達(dá)情況至今尚鮮有報(bào)道，基于此，本研究通過檢測乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表達(dá)水平，分析其表達(dá)與病人臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系，為乳腺癌的診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后判斷提供一種新方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月至2013年5月中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院首次確診為乳腺癌并行手術(shù)治療的89例病人為觀察組，年齡（63.52±8.14）歲，范圍為40～81歲。所有乳腺癌病人術(shù)前均未進(jìn)行任何治療，且符合乳腺癌手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，具有完整的臨床病例和病理資料。按2009年國際抗癌聯(lián)盟與美國癌癥聯(lián)合委員會合作制定的乳腺癌TNM分期第七版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，其中Ⅰ期24例，Ⅱ期37例，Ⅲ期28例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無轉(zhuǎn)移54例。術(shù)前均進(jìn)行血常規(guī)、肝腎功能、雙乳雙腋彩超、雙乳鉬靶腹部彩超檢查，排除自身免疫性疾病病人，心臟、腎等重要器官損傷者，合并其他惡性腫瘤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。以同時(shí)期80例健康女性體檢者作為健康對照組，年齡（65.31±8.51）歲，范圍為39～83歲。病人或近親屬自愿簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清總RNA提取 采集乳腺癌病人術(shù)前及術(shù)后和健康體檢者清晨空腹靜脈血，置于抗凝管中，離心（4℃，3 500 r/min，10 min）。取上清液?20℃保存?zhèn)溆?。使用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒（QIAGEN），嚴(yán)格按照試劑盒操作說明提取血清總RNA，DEPC處理過的超純水溶解。分光光度計(jì)檢測RNA溶液分別在260 nm和280 nm處的吸光值（A），計(jì)算RNA的濃度和純度。A260/A280比值>1.8時(shí)可用于檢測miR-20a和miR-92a。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Ⅱ RT Kit（QIA-GEN）將血清總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系共20 μL，包括1.5 μL逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（10×），0.15 μL dNTP（10 mmoL/L），1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，0.19 μL RNase抑制劑，3 μL 逆轉(zhuǎn)錄引物，5 μL 總RNA，加水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，1 h，使活化試劑中的逆轉(zhuǎn)錄酶充分活化；95℃，5 min，抑制逆轉(zhuǎn)酶作用。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系置于冰上防止10 min，然后加入200 μL無酶水，充分混勻。分裝后?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 定量PCR 利用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測miR-20a和miR-92a表達(dá)。內(nèi)參U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物 5'-AACGCTTCACGAATTTG-3'；miR-20a正向 5'-UAAAGU-GCUUAUAGUGCAGGUAG-3'，反向引物 5'-GCTAAAGTGCTTATAGTGCAGGT-3'；miR-92a正向引物 5'-GTCTCGTACCGTGAGTAAT-3'反向引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系：miRcute miRNA premix（2×）10 μL，F(xiàn)orward primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverseprimer（10 μmol/L）0.4 μL，miRNA 第一鏈cDNA 2 μL，ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，總計(jì) 45 個(gè)循環(huán)。采用 2?ΔΔCt法，以 U6 為內(nèi)參計(jì)算 miR-20a和miR-92a相對表達(dá)水平。

1.3 隨訪對所有乳腺癌病人進(jìn)行復(fù)查或者電話隨訪，隨訪時(shí)間為5年，末次隨訪時(shí)間截止至2018年5月，病人生存狀態(tài)為復(fù)發(fā)、死亡、存活；復(fù)發(fā)主要為局部復(fù)發(fā)、對側(cè)新發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。記錄病人局部復(fù)發(fā)時(shí)間、首次轉(zhuǎn)移時(shí)間及死亡時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例表示，采用χ2檢驗(yàn)。Spearman相關(guān)性分析血清miR-20a和miR-92a表達(dá)相關(guān)性，ROC曲線分析miR-20a、miR-92a以及二者聯(lián)合檢測對乳腺癌的診斷價(jià)值，Kaplan-Meier法分析miR-20a和miR-92a表達(dá)對病人5年總生存期（overall survival，OS）影響，logistic回歸分析影響乳腺癌預(yù)后的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-20a和miR-92a表達(dá)水平比較與健康對照組比，乳腺癌病人術(shù)前血清miR-20a和miR-92a表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與術(shù)前相比，乳腺癌病人術(shù)后血清miR-20a和miR-92a表達(dá)水平均顯著下降（P<0.05）。見表1。

表1 乳腺癌病人術(shù)前及術(shù)后和健康對照組血清miR-20a和miR-92a表達(dá)水平比較/±s

表1 乳腺癌病人術(shù)前及術(shù)后和健康對照組血清miR-20a和miR-92a表達(dá)水平比較/±s

組別健康對照組觀察組術(shù)前術(shù)后F值P值例數(shù)80 89 miR-20a 1.02±0.08 miR-92a 1.11±0.07 1.76±0.15 1.38±0.12 785.56 0.000 1.83±0.13 1.45±0.11 951.33 0.000

2.2 miR-20a和miR-92a表達(dá)與乳腺癌病人臨床病理特征關(guān)系分別依據(jù)乳腺癌病人術(shù)前miR-20a和miR-92a表達(dá)水平的平均值將其分為高表達(dá)病人和低表達(dá)病人。miR-20a和miR-92a表達(dá)與乳腺癌病人年齡和腫瘤直徑無關(guān)（P>0.05），與病人腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。見表2。

表2 miR-20a和miR-92a表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.3 乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表達(dá)相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌病人血清miR-20a和 miR-92a表達(dá)呈線性正相關(guān)（r=0.52，P<0.05）。

2.4 miR-20a和miR-92a水平對乳腺癌病人診斷價(jià)值ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-20a、miR-92a以及兩者聯(lián)合診斷乳腺癌的敏感度分別為77.0%、83.1%、92.1%特異度分別為78.7%、81.2%、90.0%，ROC曲線下面積（AUC）分別為0.807、0.808、0.946。與miR-20a、miR-92a單獨(dú)診斷相比，兩盒聯(lián)合診斷時(shí)敏感度、特異度以及AUC均顯著升高（P<0.05）。

2.5 生存曲線采用Kaplan-Meier法分析乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a與病人OS的影響。miR-20a和 miR-92a低表達(dá)病人OS分別為93.24%、94.85%，miR-20a和miR-92a高表達(dá)病人OS分別為73.28%、74.57%。miR-20a和 miR-92a低表達(dá)病人OS均顯著高于高表達(dá)病人（P=0.011、0.007）。

2.6 logistic回歸分析影響乳腺癌預(yù)后的因素以病人預(yù)后為因變量（復(fù)發(fā)、存活=1，死亡=0），以miR-20a、miR-92a、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，其中miR-20a、miR-92a為實(shí)測值，年齡：≥60歲=0，<60歲=1，腫瘤直徑：<3 cm=0，≥3 cm=1，分化程度：高分化=0，中分化=1，低分化=2，TNM 分期：Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ 期=2，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：是=0，否=1。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-20a和miR-92a、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響乳腺癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表3。

表3 Logistic回歸分析影響乳腺癌預(yù)后的因素

3 討論

早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療可改善乳腺癌病人預(yù)后，降低死亡率。血清腫瘤標(biāo)志物的檢測對病人無創(chuàng)傷，具有較好的重復(fù)性，并且可在同一時(shí)間點(diǎn)對多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測[6]，是腫瘤診斷和隨訪的理想手段。但是，多種腫瘤尤其是實(shí)體腫瘤標(biāo)志物存在敏感度和特異度較低等缺點(diǎn)。因此，尋找合適的腫瘤標(biāo)志物一直是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。miRNA是一類非編碼小分子RNA，長度為21-25個(gè)核苷酸，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡以及個(gè)體發(fā)育等生命活動中發(fā)揮重要作用[7]。miRNA表達(dá)廣泛，除了在腫瘤組織中異常表達(dá)外，在腫瘤病人血清中也表達(dá)異常。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理過程關(guān)系密切，除此之外，miRNA的穩(wěn)定性非常高，在高溫、過酸、過堿等環(huán)境中仍能維持穩(wěn)定[8]。因此，血清miRNA是理想的腫瘤標(biāo)志物。

miR-20a是miR-17-92基因簇中的重要成員，位于13號染色體。miR-20a在多種腫瘤中表達(dá)異常，且能夠參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，另外通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增值、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程而發(fā)揮促癌或抑癌的作用[9]。Yang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，血清 miR-20a水平與胃癌病人年齡、腫瘤分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其高表達(dá)的胃癌病人存活率較低，血清miR-20a可作為胃癌診斷、療效評估和預(yù)后的分子標(biāo)志物。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌病人血清miR-20a的表達(dá)水平顯著升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人miR-20a水平顯著高于未轉(zhuǎn)移病人，ROC曲線分析顯示miR-20a具有較高的敏感性和特異性，可能是檢測宮頸癌病人淋巴結(jié)狀態(tài)的潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌病人血清miR-20a水平較健康體檢者顯著升高，miR-20a高表達(dá)與腫瘤分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示miR-20a參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-20a診斷乳腺癌的敏感度為77.0%，特異度為78.7%、AUC為0.807，說明miR-20a對乳腺癌的診斷具有一定價(jià)值。miR-20a高表達(dá)病人的OS顯著低于低表達(dá)病人，是影響乳腺癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-20a高表達(dá)與病人預(yù)后不良相關(guān)，可作為乳腺癌預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。

血清指標(biāo)的聯(lián)合檢測可提高疾病的診斷率和預(yù)后判斷。洪宏等[12]研究發(fā)現(xiàn)血清miR-765和CA153聯(lián)合檢測對乳腺癌的診斷效能高于單一指標(biāo)檢測。張文昭等[13]研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌病人血清中miR-21、miR-195和miR-222表達(dá)水平均升高，三種指標(biāo)的聯(lián)合檢測顯著提高乳腺癌診斷的AUC、靈敏度和特異度，對早期乳腺癌有較高的診斷價(jià)值，有助于早期乳腺癌的篩查和診斷。miR-92a也是miR-17-92基因簇中的重要成員，在多種腫瘤中表達(dá)異常，與miR-20a聯(lián)合檢測可能會提高腫瘤的診斷率。仇俊蘭、奉林[14]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌病人血清miR-92a水平較健康對照組顯著升高，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組血清miR-92a水平顯著高于無轉(zhuǎn)移組，用于結(jié)直腸癌診斷時(shí)的靈敏度和特異度分別為75.3%和88.3%，是結(jié)直腸癌病人的早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，其水平上調(diào)病人預(yù)后較差。Kong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌病人血清miR-92a的表達(dá)顯著高于健康志愿者，晚期宮頸癌病人血清miR-92a表達(dá)高于早期病人，ROC分析顯示，miR-92a診斷宮頸癌的靈敏度和特異性分別為69.6%和80.4%，AUC為0.808，血清miR-92a水平可作為宮頸癌診斷的獨(dú)立標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，與健康體檢者相比，乳腺癌病人血清miR-92a水平顯著升高，miR-92a高表達(dá)與腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM分期關(guān)系密切，提示miR-92a在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-92a診斷乳腺癌的敏感度分別為83.1%、特異度為81.2%、AUC為0.808，具有較高的診斷價(jià)值。miR-92a是影響乳腺癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其高表達(dá)病人OS顯著低于低表達(dá)病人，提示miR-92a高表達(dá)病人的預(yù)后較差，可作為乳腺癌預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-20a和miR-92a表達(dá)呈正相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的AUC、敏感度和特異度均顯著升高，提示miR-20a和miR-92a聯(lián)合檢測可提高乳腺癌病人的診斷效能。另外通過logistic回歸分析顯示，miR-20a和miR-92a、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度均是影響乳腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，此結(jié)果進(jìn)一步說明血清miR-20a和miR-92a表達(dá)水平不僅與乳腺癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，同時(shí)也是影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

綜上，乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表達(dá)水平均顯著升高，與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，聯(lián)合檢測兩者血清水平有助于乳腺癌的診斷，可能成為乳腺癌病人預(yù)后的分子標(biāo)志物。進(jìn)一步深入研究miR-20a和miR-92a在乳腺癌中發(fā)揮作用的分子學(xué)機(jī)制，可能為乳腺癌分子治療提供新靶點(diǎn)。