智炎偉
葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)是原發(fā)性眼內惡性腫瘤,易轉移,預后差且易致死,目前生存率雖有一定改善但還很低[1]。尋找有效的治療藥物具有重要的臨床意義。小白菊內酯(parthenolide,PTL)是從菊科植物中提取出來的倍半萜類化合物,具有抗腫瘤的生物活性,PTL可以抑制胰腺癌Panc-1細胞的增殖并促進其凋亡,同時也影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[2]。研究發(fā)現(xiàn)PTL能顯著抑制腎癌786-O細胞增殖,誘導786-O細胞發(fā)生凋亡[3];PTL通過阻滯G1期并調節(jié)線粒體途徑抑制UM細胞增殖并誘導其凋亡[4]。但小白菊內酯是否通過核因子-κB(Nuclear factor κB,NF-κB)信號通路影響葡萄膜黑色素瘤細胞的發(fā)生發(fā)展還尚未清楚,本研究自2019年3―10月研究小白菊內酯是否通過NF-κB調控葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖和凋亡。
1.1 材料葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B購自中國科學院上海細胞庫;小白菊內酯(分子式C15H20O3,純度>98%,貨號X-028)購自成都瑞芬思生物科技有限公司;胎牛血清(貨號12003C-500 mL)、RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號R1145-500 mL)、胰蛋白酶(貨號T8802)購自美國Sigma公司;MTT試劑盒(貨號C0009)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin VFITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒(貨號C1065L)、BCA試劑盒(貨號P0012S)、RIPA蛋白裂解液(貨號P0013B)、SDS-PAGE試劑盒(貨號P0012AC)購自上海碧云天生物技術有限公司;吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)(貨號5108-96-3)、佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol12-myristate-13-acetate,PMA)(貨號 P1585)購自美國Sigma公司。Bcl-2相關X(Bax)(貨號orb146710)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)(貨號 orb99415)、IkBa(貨號abx104016)、NF-κB(貨號AOB1331a)一抗均購自上海煊翎生物科技有限公司;p-IkBa(貨號bs-18129R-1)抗體購自上海恒斐生物科技有限公司;山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)(貨號ANR02-1)購自上海子起生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) 葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%二氧化碳飽和濕度條件下培養(yǎng),隔天換液一次,待細胞融合至70%左右時,加入胰蛋白酶進行消化傳代,選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。
1.2.2 細胞分組 取對數(shù)生長期細胞,將其接種至96孔板中,并用不同濃度的小白菊內酯(0、5、10、20 μg/mL)處理MUM2B細胞,記為0 μg/mL組、5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組;用1 μmol/L的PMA作用于WM239細胞培養(yǎng)24 h,記為PMA組;用1 μmol/L的PMA作用于MUM2B細胞培養(yǎng)1 h后再加入10 μmol/L的PDTC培養(yǎng)24 h,記為PDTC組;未經任何處理的MUM2B細胞作對照組。10 μg/mL的小白菊內酯和1 μmol/L的PMA共同作用于MUM2B細胞,記為10 μg/mL+PMA組。
1.2.3 MTT檢測細胞增殖 在以上各組細胞培養(yǎng)至24、48、72、96 h時分別加入20 μL(5 g/L)的MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h;棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO振蕩反應10 min,酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組重復3次。
1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各組細胞,離心收集,PBS漂洗2次,加結合緩沖液重懸細胞。依據(jù)試劑盒說明書,先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。
1.2.5 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白,BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜,TBST洗膜;加入二抗(1∶2 000)室溫孵育 2 h,TBST洗滌 3次,每次 10 min,后在暗室中曝光顯影,再浸入定影,最后洗去殘液晾干,將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理,測定各組蛋白條帶的吸光度,以目的條帶和βactin條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。
1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.00進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示,兩組比較行t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 小白菊內酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖的影響與小白菊內酯0 μg/mL組相比,不同濃度小白菊內酯處理后分別在24、48、72、96 h時檢測細胞活性,結果顯示MUM2B細胞活性顯著降低(P<0.05)。可見,小白菊內酯抑制MUM2B細胞的增殖。見表1。
表1 小白菊內酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖的影響/±s
表1 小白菊內酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖的影響/±s
注:①與0 μg/mL組比較,P<0.05。
小白菊內酯水平0 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL 20 μg/mL F值P值細胞活性(OD=490 nm)96 h 1.12±0.09 0.85±0.08①0.47±0.03①0.21±0.03①213.29 0.000重復次數(shù)24 h 0.54±0.05 0.49±0.05①0.41±0.06①0.35±0.04①25.03 0.000 48 h 0.73±0.07 0.56±0.09①0.43±0.04①0.30±0.07①71.06 0.000 9 9 9 9 72 h 0.97±0.08 0.73±0.09①0.46±0.05①0.25±0.04①172.72 0.000
2.2 小白菊內酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B凋亡的影響與小白菊內酯0 μg/mL組相比,不同濃度小白菊內酯組MUM2B細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);Bax表達水平顯著升高,Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)??梢姡“拙諆弱ゴ龠M葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B凋亡。見圖1,2和表2。
圖1 小白菊內酯對MUM2B細胞凋亡的影響
圖2 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測小白菊內酯對MUM2B細胞凋亡相關蛋白表達量的影響
表2 小白菊內酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B凋亡的影響/±s
表2 小白菊內酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B凋亡的影響/±s
注:Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2;Bax為Bcl-2相關X。①與0 μg/mL組比較,P<0.05。
小白菊內酯水平Bcl-2重復次數(shù) 凋亡率/%凋亡相關蛋白表達Bax 0 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL 20 μg/mL F值P值0.91±0.09 0.53±0.07①0.35±0.04①0.20±0.03①217.92 0.000 9 9 9 9 5.54±0.56 13.19±1.65①28.49±3.90①49.36±4.27①368.71 0.000 0.21±0.03 0.36±0.05①0.58±0.07①0.85±0.08①189.88 0.000
2.3 小白菊內酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B的NF-κB信號通路的影響與小白菊內酯0 μg/mL組相比,小白菊內酯10 μg/mL組p-IkBa、NF-κB p65的表達水平顯著降低(P<0.05);IkBa的表達水平差異無統(tǒng)計學意義??梢?,小白菊內酯抑制葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B的NF-κB信號通路。見表3,圖3。
表3 蛋白質印跡法檢測小白菊內酯對MUM2B細胞的核因子-κB(NF-κB)信號通路的影響/±s
表3 蛋白質印跡法檢測小白菊內酯對MUM2B細胞的核因子-κB(NF-κB)信號通路的影響/±s
注:①與0 μg/mL組比較,P<0.05。
小白菊內酯水平0 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL 20 μg/mL F值P值NF-κB p65 0.93±0.12 0.70±0.08①0.33±0.04①0.21±0.03①170.31 0.000重復次數(shù)9 9 9 9 IkBa 0.97±0.09 0.96±0.14 0.95±0.12 0.98±0.10 0.12 0.951 p-IkBa 0.81±0.11 0.48±0.06①0.29±0.03①0.17±0.02①165.09 0.000
圖3 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測小白菊內酯對MUM2B細胞的核因子-κB(NF-κB)信號通路的影響
2.4 NF-κB信號通路對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖、凋亡的影響與Control組相比,PDTC組Bax表達水平顯著升高,Bcl-2表達水平顯著降低,細胞活性顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.05);PMA組Bax表達水平顯著降低,Bcl-2的表達水平顯著升高,細胞活性顯著升高,凋亡率顯著降低(P<0.05)。可見,抑制NF-κB信號通路可抑制葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖,促進細胞凋亡;而NF-κB信號通路激活MUM2B細胞增殖增加,凋亡減少。見表4,圖4。
表4 NF-κB信號通路對MUM2B細胞增殖、凋亡的影響/±s
表4 NF-κB信號通路對MUM2B細胞增殖、凋亡的影響/±s
注:PDTC為吡咯烷二硫代氨基甲酸酯,PMA為佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯,Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2,Bax為Bcl-2相關X。與對照組比較,①P<0.05。
組別對照組PDTC PMA F值P值細胞活性(OD=490 nm)重復次數(shù)Bcl-2 0.93±0.09 0.31±0.03①1.52±0.12①94.68 0.000 9 9 9 24 h 0.51±0.05 0.40±0.04①0.63±0.09①29.29 0.000 48 h 0.71±0.07 0.49±0.06①0.91±0.07①88.93 0.000 72 h 0.94±0.12 0.56±0.08①1.21±0.13①76.37 0.000 96 h 1.09±0.09 0.61±0.08①1.42±0.11①81.55 0.000凋亡率/%5.16±0.56 17.18±1.65①2.53±0.31①525.86 0.000凋亡相關蛋白表達Bax 0.23±0.05 0.57±0.07①0.12±0.03①145.10 0.000
圖4 蛋白質印跡法檢測NF-κB信號通路對MUM2B細胞的凋亡相關蛋白表達量的影響
2.5 小白菊內酯通過NF-κB信號通路影響葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B的增殖和凋亡與0 μg/mL組相比,10 μg/mL小白菊內酯組Bax表達水平顯著升高,Bcl-2表達水平顯著降低,細胞活性顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.05);與 10 μg/mL組相比,10μg/mL+PMA組Bax表達水平顯著降低,Bcl-2表達水平顯著升高,細胞活性顯著升高,凋亡率顯著降低(P<0.05)。
可見,NF-κB信號通路激活能夠逆轉小白菊內酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B的增殖抑制和凋亡促進的作用。見表5,圖5。
表5 小白菊內酯通過NF-κB信號通路對MUM2B細胞增殖、凋亡的影響/±s
表5 小白菊內酯通過NF-κB信號通路對MUM2B細胞增殖、凋亡的影響/±s
注:PMA為佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯,Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2,Bax為Bcl-2相關X。與0 μg/mL組比較,①P<0.05。 ②與10 μg/mL組相比,P<0.05。
小白菊內酯水平細胞活性(OD=490 nm)重復次數(shù)24 h Bcl-2 48 h 72 h 96 h 凋亡率/%凋亡相關蛋白表達Bax 0.52±0.05 0.39±0.07①0.47±0.09②8.77 0.001 0 μg/mL 10 μg/mL 10 μg/mL+PMA F值P值0.91±0.09 0.40±0.05①0.85±0.08②99.56 0.000 9 9 9 0.71±0.07 0.42±0.06①0.63±0.07②73.81 0.000 0.93±0.12 0.45±0.08①0.81±0.13②83.36 0.000 1.08±0.09 0.46±0.08①0.94±0.10②97.28 0.000 5.31±0.52 26.13±3.18①9.53±1.21②276.09 0.000 0.21±0.03 0.97±0.12①0.30±0.40②123.24 0.000
圖5 蛋白質印跡法檢測MUM2B細胞中凋亡相關蛋白的表達
葡萄膜黑色素瘤具有高度的侵襲性和轉移性,對人類健康危害極大[5]。近年來發(fā)現(xiàn)部分中藥也可抗黑色素瘤,且不良反應輕微[6]。研究發(fā)現(xiàn)PTL可誘導細胞凋亡,抑制非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲[7]。PTL通過抑制Bcl-2,NF-κB的表達能抑制宮頸癌Hela細胞株生長與遷移能力[8];PTL還能抑制人肝癌、前列腺癌細胞的增殖,誘導細胞凋亡[9-10]。本實驗研究結果發(fā)現(xiàn),小白菊內酯可抑制Bcl-2蛋白的表達,促進Bax蛋白的表達;抑制黑色素瘤細胞MUM2B的增殖,促進其凋亡。
NF-κB是真核細胞轉錄因子家族,該信號通路的激活常與腫瘤的發(fā)生密切相關[11]。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路的激活與葡萄膜黑色素瘤的不良預后有關[12]。抑制NF-κB活性可抑制胃癌細胞增殖、侵襲,促進細胞凋亡[13]。PMA是蛋白激酶C的激動劑,活化蛋白激酶C時可使IkBa磷酸化,與NF-κB分離,激活NF-κB信號通路;PDTC是一種抗氧化劑,能阻止IkBa磷酸化,阻止NF-κB活化進入細胞核,從而抑制NF-κB信號通路[14]。本研究用PMA和PDTC處理黑色素瘤細胞MUM2B,發(fā)現(xiàn)PMA作用后細胞活性升高,細胞凋亡減少;PDTC作用后細胞活性降低,細胞凋亡增多。說明抑制NF-κB信號通路抑制MUM2B細胞增殖,促進細胞凋亡;而激活NF-κB信號通路促進細胞增殖,抑制細胞凋亡。此外,研究發(fā)現(xiàn)PTL可抑制缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)信號傳導和缺氧誘導的大腸癌上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[15]。PTL可通過下調雷帕霉素/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(mammalian target of rapamycin/phosphoinositide 3 kinese/protein kinase B,mTOR/PI3K/AKT)信號通路來激活自噬和凋亡,從而抑制MDA-T32乳頭狀甲狀腺癌細胞[16]。本實驗結果表明,PTL能抑制NF-κB信號通路的激活,而激活NF-κB信號通路可逆轉PTL對MUM2B細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。提示PTL可能通過NF-κB信號通路影響葡萄膜黑色素瘤的進展。
綜上所述,小白菊內酯抑制黑色素瘤細胞MUM2B的增殖,促進其凋亡,可能與NF-κB信號通路相關,將可為黑色素瘤的治療提供新思路和新靶點。