硅膠表面霉酚酸分子印跡聚合物的合成及應(yīng)用

彭侃霖，周 豪，劉 戎，孫 堅，丘鏡莉，熊仁萍，賀利民

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/國家獸藥殘留基準實驗室,廣東 廣州 510642)

霉酚酸 (Mycophenolic acid)是青霉菌Penicillium產(chǎn)生的弱酸性次級代謝產(chǎn)物[1]，具有一定的抗霉菌、抗細菌和抗病毒活性[2-3]，也是霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil)在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物，可抑制器官移植時的排異反應(yīng)[4]。全球約25%的農(nóng)作物受到霉菌毒素的污染[5]，青貯飼料作為反芻動物的重要飼料，在加工、儲存和運輸時，處理不當容易產(chǎn)生霉變。青霉菌是霉變青貯飼料中常見的菌株[6]，青貯飼料中霉酚酸平均含量可達256～7 656 μg/kg[7-9]。霉變青貯飼料中毒素成分復(fù)雜，逐一檢測較為困難，而霉酚酸作為青霉菌污染飼料的標志物，在受污染青貯飼料中具有代表性，可間接反映青貯飼料中霉菌毒素的水平[1]。此外，動物如果長期暴露于含霉酚酸的青貯飼料環(huán)境下，免疫力下降，容易受感染性疾病的侵襲[10]。因此建立能準確可靠地測定青貯飼料中霉酚酸含量的方法，從而評價青貯飼料的質(zhì)量具有實踐意義。

基質(zhì)中霉酚酸檢測的報道常見于血漿[11]和尿液[12]中，也以瘤胃液作為基質(zhì)[13]，而霉酚酸分析測定方法大多只是經(jīng)過簡單的前處理[14]，缺乏特異性，檢測易受干擾，研發(fā)新的高選擇性凈化方法十分必要。分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer，MIP)對目標物的結(jié)合具有特異性，結(jié)合固相萃取技術(shù)，采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)法[15]可檢測人血漿中的霉酚酸，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS)法[5]可完成對青貯飼料中霉酚酸的檢測；然而采用本體聚合法制備的聚合物存在傳質(zhì)速度慢、識別位點被包裹和模板難以洗脫等缺陷[16-17]。以硅膠作為載體的表面分子印跡聚合技術(shù)是一種在硅膠表面發(fā)生印跡的方法[18]，目標物傳質(zhì)速度快，模板洗脫容易；因此，本研究探究了霉酚酸-硅膠表面分子印跡聚合物的合成，作為固相萃取吸附填料評價其對霉酚酸的吸附保留能力，最后構(gòu)建分子印跡固相萃取-HPLC法測定青貯飼料中霉酚酸含量，為青貯飼料中霉菌毒素污染水平的監(jiān)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1 260 型高效液相色譜儀 (Agilent公司)，SHA-B型恒溫水浴振蕩器(常州國華電器有限公司)，KH7200DB型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，Velocity 18R高速冷凍離心機(Dynamica公司)，EVOMA 15掃描式電子顯微鏡(ZEISS 公司)。

霉酚酸酯原料藥(上海源葉生物科技有限公司)、霉酚酸均購自MedChemExpress公司。硅膠購自Silicycle公司，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)、甲基丙烯酸(MAA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、甲基丙烯酸-2-羥基乙酯(HEMA)均購自Sigma-Aldrich公司，2-乙烯基吡啶(2-VP)和4-乙烯基吡啶(4-VP)購自Alfa Aesar公司，丙烯酰胺(AM)購自上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，衣康酸(IA)購自J＆K Scientific公司。丙酮、三氯甲烷購自廣州化學(xué)試劑廠，甲醇、乙腈均為色譜純，超純水由Millipore MilliQ系統(tǒng)制備，青貯飼料由某飼料廠提供。

1.2 方法

1.2.1 SiO2-MPS 的制備 稱 5 g 干燥硅膠于 150 mL圓底燒瓶中，加入適量6 mol/L鹽酸，混勻后于80 ℃油浴中攪拌10 h，冷卻至室溫后，離心棄上清液，沉淀物不斷用水洗滌至中性，60 ℃真空干燥24 h，得到活化硅膠[19]。

取5 g活化硅膠于三頸圓底燒瓶中，依次加入100 mL 無水甲苯、5 mLγ-MPS 和 1 mL 三乙胺，混勻，在氬氣保護下，120 ℃條件下加熱回流12 h。將混合物離心棄上清液，沉淀依次用甲醇、超純水交替洗滌，60 ℃條件下真空干燥，得到SiO2-MPS(改性硅膠)。1.2.2 SiO2-MPS@MIP 的制備 將 1 mmol的霉酚酸酯溶于 80 mL 乙腈中，加入 2 mmol MAA，渦旋、超聲混勻，在冰浴下磁力攪拌6 h后，依次加入0.6 g SiO2-MPS、20 mmol EGDMA 和 40 mg AIBN，超聲混勻，通入氬氣 10 min，密封，60 ℃ 油浴下磁力攪拌24 h。將聚合物依次用甲醇、超純水和φ為10%的乙酸甲醇溶液洗滌，用超純水、甲醇去除殘留的乙酸，直到檢測不到模板分子后，于60 ℃ 條件下真空干燥 24 h，備用。

SiO2-MPS@NIP的制備：不加入霉酚酸酯，將2 mmol MAA 溶于 80 mL 乙腈中，超聲混勻、磁力攪拌后加入與制備SiO2-MPS@MIP相同量的SiO2-MPS、EGDMA和 AIBN，混勻后通氮氣，密封，60 ℃油浴下磁力攪拌24 h。依次用水和甲醇洗滌SiO2-MPS@NIP后，于 60 ℃ 條件下真空干燥 24 h，備用。

1.2.3 材料的表征 通過掃描電鏡觀察活化硅膠、SiO2-MPS、SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP的形貌特征。

1.2.4 吸附試驗 稱取 20 mg 干燥聚合物粉末于25 mL玻璃錐形瓶中，加入5 mL含有一定濃度霉酚酸的乙腈溶液，25 ℃條件下在恒溫振蕩水浴鍋中振蕩 24 h，4 000 r/min 離心 10 min，取上清液并過0.22 μm微孔濾膜，HPLC測定。每個濃度準備3份平行樣，取算術(shù)平均值。吸附量(Q)按照公式(1)計算，印跡因子 (Impringting factor,IF)按公式 (2)計算。

式中，Q為吸附量，mg/g； ρ0和ρe分別是霉酚酸的初始質(zhì)量濃度和達平衡時上清液中霉酚酸的質(zhì)量濃度，mg/L；V為溶液體積，mL；m為稱取的聚合物質(zhì)量，mg；QMIP和QNIP分別為 SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP的吸附量，mg/g。

1.2.5 分子印跡固相萃取柱制備及固相萃取試驗

將制備好的干燥聚合物裝填于1 mL聚丙烯固相萃取空柱中，兩端用配套的濾板封堵，輕輕壓實，制備成分子印跡固相萃取(Molecularly imprinted polymer solid phase extraction)小柱。固相萃取柱依次用 1 mL 的甲醇、超純水活化，1mL 100 mg/L 的霉酚酸溶液上樣，1 mL 10%(φ)甲醇溶液淋洗和2%(φ)乙酸甲醇溶液洗脫，洗脫溶液吹干后用1 mL流動相復(fù)溶，進行HPLC測定。

1.2.6 樣品的前處理過程 稱取 5 g 青貯飼料，添加適量霉酚酸標準溶液，渦旋混勻，室溫下靜置20 min。加入20 mL乙腈，經(jīng)提取、振蕩、離心后取10 mL上清液吹至近干，用2 mL酸性水(pH=6)溶解殘留物，過固相萃取小柱，按“1.2.5”處理，上機測定。

1.2.7 HPLC 條件 色譜柱：Aglient Extend-C18 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；檢測波長：250 nm；流動相：A相為乙腈(含體積分數(shù)為0.3%的甲酸)，B相為體積分數(shù)為0.3%的甲酸溶液，流動相比例為VA∶VB= 60∶40；流速：1 mL /min；進樣量：20 μL。1.2.8 霉酚酸檢測方法的評價 采用色譜純乙腈稀釋霉酚酸標準儲備液，配制成 0.5、1、2、5、10、20、50、100 mg/L的標準溶液，HPLC檢測。以吸收峰面積(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線。

向空白青貯飼料中添加適量霉酚酸標準溶液，經(jīng)前處理后上機檢測，以3倍(S/N≥3)和10倍(S/N≥10)信噪比作為檢測限和定量限。

向空白青貯飼料中添加霉酚酸標準溶液，配制成低 (200 μg/kg)、中 (2 000 μg/kg)和高 (8 000 μg/kg)3個添加水平，前處理后上機檢測。每個濃度做5個平行樣，測定3批次，以同一批次和3批次的平均回收率作為日內(nèi)和日間回收率，以相對標準偏差(Relative standard deviation)表示精密度。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 軟件分析，采用Origin 2019b繪制統(tǒng)計圖，采用Duncan’s法進行多重比較，顯著性差異水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物制備條件的優(yōu)化

2.1.1 致孔劑的選擇 乙腈作為致孔劑時SiO2-MPS@MIP吸附量最高，為3.7 mg/g，印跡因子達到2.1。如表1所示，向乙腈中添加少量三氯甲烷時，SiO2-MPS@MIP吸附量下降，隨著三氯甲烷添加比例的升高，吸附量呈現(xiàn)先增大后降低最后穩(wěn)定的趨勢；SiO2-MPS@NIP的吸附量隨著三氯甲烷添加比例的升高而增加，最后與SiO2-MPS@MIP的吸附量基本一致；印跡因子呈下降趨勢。當致孔劑全為三氯甲烷時，聚合物呈塊狀，不適合進一步試驗。后續(xù)試驗以乙腈為致孔劑。

表1 乙腈溶液中不同三氯甲烷添加比例對S i O2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP吸附量的影響Table 1 The influence of different addition proportions of chloroform in acetonitrile on the adsorption capacity of SiO2-MPS@MIP and SiO2-MPS@NIP

2.1.2 模板和單體的優(yōu)化 選擇霉酚酸的結(jié)構(gòu)類似物霉酚酸酯作為虛擬模板，比較了堿性單體(2-VP和4-VP)、中性單體(AM和HEMA)和酸性單體(IA和MAA)對印跡因子的影響，結(jié)果如圖1A所示，MAA合成時印跡因子顯著高于其他組合(P＜0.05)，2-VP和HEMA參與合成時印跡因子無顯著差異(P＞0.05)，但顯著高于單體為AM和IA時的印跡因子 (P＜0.05)。

圖1 不同單體種類(A)和不同模板單體摩爾比(B)對印跡因子的影響Fig.1 The influence of different monomer types (A) and different mole ratios of template to monomer (B) on impringting factor

考察不同的模板單體摩爾比 (1∶1、1∶2、1∶4、1∶6和1∶8)對印跡因子的影響，結(jié)果如圖1B所示，模板單體摩爾比為1∶2時，印跡因子顯著高于其他組合 (P＜0.05)，模板單體摩爾比為 1∶1和 1∶4時印跡因子之間無顯著差異(P＞0.05)，但均顯著高于模板單體摩爾比為1∶6和1∶8時的印跡因子(P＜0.05)。

2.2 聚合物的表征

2.2.1 聚合物表面形貌觀察 對活化硅膠、SiO2-MPS、SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP進行掃描電鏡分析，結(jié)果如圖2所示，活化硅膠和SiO2-MPS表面光滑，而SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP表面粗糙，均有聚合物包裹在硅球表面，包裹在SiO2-MPS@NIP表面的聚合物更多且致密。

圖2 活化硅膠(A)、SiO2-MPS (B)、SiO2-MPS@MIP(C)和SiO2-MPS@NIP(D)的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope images of activated silica gel (A),SiO2-MPS (B),SiO2-MPS@MIP (C) and SiO2-MPS@NIP (D)

2.2.2 聚合物吸附性能的研究 靜態(tài)吸附試驗研究了霉酚酸不同初始濃度對聚合物吸附量的影響，結(jié)果如圖3A所示，在10～250 mg/L范圍內(nèi)，隨著霉酚酸質(zhì)量濃度的增加，SiO2-MPS@NIP和SiO2-MPS@MIP的吸附量增加，SiO2-MPS@MIP在霉酚酸質(zhì)量濃度為250 mg/L時趨于飽和，飽和吸附量為 4.5 mg/g。

圖3 SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP的靜態(tài)(A)和動態(tài)(B)吸附曲線Fig.3 Static (A) and dynamic (B) adsorption curves of SiO2-MPS@MIP and SiO2-MPS@NIP

動態(tài)吸附試驗研究了吸附時間對聚合物吸附量的影響，在質(zhì)量濃度為100 mg/L的霉酚酸溶液下進行動態(tài)吸附試驗，結(jié)果如圖3B所示，SiO2-MPS@NIP在30 min內(nèi)達到吸附平衡，SiO2-MPS@MIP在30 min內(nèi)吸附速率較快，60 min時達到吸附平衡。

2.3 分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 上樣溶液對霉酚酸回收率的影響 研究甲醇、乙腈、三氯甲烷和超純水為上樣溶液對霉酚酸回收率的影響，如圖4A所示，超純水作上樣溶液時分子印跡固相萃取柱對霉酚酸的回收率可達到90%以上，高于非印跡固相萃取柱。在實際樣品的考察中，比較不同pH水作為上樣溶液過分子印跡固相萃取柱的效果，結(jié)果如圖4B所示，隨著pH的增加，分子印跡固相萃取柱和非印跡固相萃取柱對霉酚酸的回收率先增加后下降，在pH為6的時候分子印跡固相萃取柱的回收率最高，高于非印跡固相萃取柱的。

圖4 不同上樣溶液(A)及不同pH水(B)對霉酚酸回收率的影響Fig.4 The influences of different loading solutions (A) and different pH water (B) on mycophenolic acid recovery rate

2.3.2 淋洗溶液及洗脫溶液對霉酚酸回收率的影響

分別采用不同體積分數(shù)的甲醇溶液(1%、5%、10%和20%)和乙腈溶液(10%和20%)淋洗，如圖5A所示，分子印跡固相萃取柱對霉酚酸的回收率高于非印跡固相萃取柱。與乙腈溶液相比，采用甲醇溶液淋洗分子印跡固相萃取柱時霉酚酸回收率高，損失小。當甲醇溶液中甲醇體積分數(shù)大于10%時，有機相含量增加，回收率下降；當甲醇體積分數(shù)在10%以下時，回收率均大于90%。與體積分數(shù)為1%和5%甲醇溶液相比，體積分數(shù)為10%的甲醇溶液中有機相比例更高，容易除去實際樣品中脂溶性雜質(zhì)，因此選擇體積分數(shù)為10%的甲醇溶液作為淋洗溶液。

圖5 不同淋洗溶液(A)和洗脫溶液(B)對霉酚酸回收率的影響Fig.5 The influences of different washing solutions (A) and elution solutions (B) on mycophenolic acid recovery rate

如圖5B所示，分別考察了體積分數(shù)為1%、2%、5%和8%的乙酸甲醇溶液洗脫的效果，結(jié)果表明，分子印跡固相萃取柱對霉酚酸的回收率高于非印跡固相萃取柱，適當增加乙酸的比例可以有效提高洗脫的效率，但是酸過多時回收率基本保持不變，因此選擇體積分數(shù)為2%的乙酸甲醇溶液為洗脫溶液即可。

2.4 霉酚酸檢測方法的評價

霉酚酸在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)線性良好(R2=0.999)，檢測限和定量限分別為 60 和 200 μg/kg。過分子印跡固相萃取柱前后HPLC色譜圖見圖6，回收率數(shù)據(jù)見表2。霉酚酸的回收率為76.0%～81.2%，相對標準偏差為3.3%～6.6%。

表2 空白樣品中霉酚酸的加標回收率及相對標準偏差(RSD)Table 2 Recovery rates of spiked mycophenolic acid and the relative standard deviation (RSD) in the blank sample

圖6 過分子印跡固相萃取柱前(A)和經(jīng)分子印跡固相萃取柱凈化后(B)的加標青貯飼料(2 000 μg/kg)以及相應(yīng)的標準溶液(C)HPLC-UVD色譜圖Fig.6 HPLC-UVD chromatograms of the spiked silage(2 000 μg/kg) before (A) and after (B) purification by the molecularly imprinted polymer solid phase extraction column and the corresponding standard solution (C)

對20份青貯飼料樣品進行檢測，結(jié)果顯示，在3份樣品中檢出霉酚酸，質(zhì)量分數(shù)分別為227、391和1 770 μg/kg，其他樣品中未檢出霉酚酸。

3 討論與結(jié)論

試驗結(jié)果顯示三氯甲烷降低了SiO2-MPS@MIP的特異性，這是因為三氯甲烷會導(dǎo)致聚合物溶脹、擠壓甚至破壞特異性孔穴，從而降低聚合物的特異性[20]。De Smet等[5]采用堿性單體 4-VP 合成，采用LC-MS/MS法檢測霉酚酸，而本研究采用酸性單體MAA進行合成，制備的分子印跡固相萃取小柱對霉酚酸凈化效果良好，表明霉酚酸酯除了通過氫鍵與MAA在立體結(jié)構(gòu)上相匹配外，霉酚酸酯中的含氮基團嗎啉與MAA存在靜電相互作用，增強了預(yù)聚物的穩(wěn)定性，從而提高了SiO2-MPS@MIP特異性識別能力。結(jié)合表征結(jié)果并分析聚合物動靜態(tài)吸附曲線發(fā)現(xiàn)，由于硅球表面成功覆蓋了聚合物層，霉酚酸更容易進入孔穴中，因此與De Smet等[5]采用的本體聚合法相比，表面印跡法制備的印跡聚合物達平衡時間更短，可節(jié)約試驗時間?？疾炀酆衔镅b柱后的效果，由于疏水作用參與了目標物與印跡聚合物的識別過程[21]，促進了霉酚酸的保留，因此上樣溶液為水時更好。進一步研究發(fā)現(xiàn)，霉酚酸在過酸或過堿條件下回收率低，因為pH較低時，過多的氫離子會競爭性地結(jié)合霉酚酸中的氧原子，阻礙霉酚酸與填料之間氫鍵的形成，而pH較高時，填料中的羧基基本完全電離，也不利于霉酚酸與填料的結(jié)合[22]。

本研究利用表面印跡聚合法成功制備出對霉酚酸具有吸附特異性的硅膠表面接枝分子印跡聚合物，聚合物具有良好吸附能力和傳質(zhì)速度，建立的合成印跡聚合物固相萃取-HPLC法可凈化、富集和檢測青貯飼料中的霉酚酸，為青貯飼料的質(zhì)量安全控制提供指導(dǎo)。