膽堿對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響

楊敏,楊彩霞,李亞南,雷智琦,王根林,李蓮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

熱應(yīng)激是機體對不利于其正常生理活動的高溫環(huán)境所產(chǎn)生的一系列非特異性免疫應(yīng)答的防御反應(yīng)[1]。奶牛是對高溫最敏感的牲畜之一[2],過熱會降低它們的繁殖和生產(chǎn)性能[3-4]。有研究報道,外部溫度升高引起的熱應(yīng)激通常會導(dǎo)致奶牛食欲和采食量的下降,直接影響奶牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì),給乳品行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[5-6]。因此,如何緩解奶牛熱應(yīng)激、保證奶牛高產(chǎn),是我國奶牛業(yè)所面臨的巨大挑戰(zhàn)。

乳腺是雌性動物特有的一種外分泌腺,也是動物將必需的營養(yǎng)物質(zhì)進行加工并合成為乳汁的重要場所,其健康的生理狀態(tài)是保證乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)的首要條件[7]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)奶牛發(fā)生熱應(yīng)激時,熱應(yīng)激會抑制奶牛乳腺組織的生長,破壞奶牛免疫功能,造成泌乳期產(chǎn)奶量減少[8]。同時,為了彌補熱應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)損失,乳腺會通過合成更多的蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞與細(xì)胞之間的正常連接,維持其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,發(fā)揮其正常泌乳功能[9]。其中,乳腺上皮細(xì)胞是參與乳腺合成乳汁過程中最重要的泌乳細(xì)胞,其數(shù)量和質(zhì)量在一定程度上決定奶牛的產(chǎn)奶量,且在乳腺發(fā)育及泌乳過程中乳腺細(xì)胞不斷地進行增殖和分化[10]。但高溫環(huán)境會抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖活性。因此,體外培養(yǎng)并研究奶牛乳腺上皮細(xì)胞,對預(yù)防和控制熱應(yīng)激奶牛的乳腺功能異常具有重要意義。

在現(xiàn)代奶牛場中,管理者采取多種方法來預(yù)防和控制熱應(yīng)激的發(fā)生,主要有物理降溫及營養(yǎng)調(diào)控2種方式[11]。膽堿(choline)是一種水溶性季胺[12],作為滲透壓物質(zhì),在維持正常細(xì)胞體積中起著重要作用[13],并能通過代謝轉(zhuǎn)化為甜菜堿和甘油-磷酸膽堿[14]。膽堿同樣具有抗氧化作用,能夠提高奶牛免疫功能[15-16]。此外,膽堿的代謝產(chǎn)物包括合成代謝產(chǎn)物和分解代謝產(chǎn)物,如:?；撬?、谷胱甘肽過氧化物酶等,其對細(xì)胞增殖和細(xì)胞程序性死亡具有重要作用[17],但其具體的機制尚不明確。在研究膽堿對熱應(yīng)激奶牛的影響中發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激條件下,奶牛日糧中添加過瘤胃膽堿,能提高牛群產(chǎn)奶量和乳汁質(zhì)量,且可有效激活奶牛在熱應(yīng)激環(huán)境下的自我調(diào)節(jié),緩解熱應(yīng)激造成的損傷[18-19]。因此,膽堿可能是預(yù)防或治療奶牛熱應(yīng)激引起的奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡損傷的潛在藥物。但目前關(guān)于膽堿對熱應(yīng)激奶牛乳腺上皮細(xì)胞的作用機制尚不清楚。據(jù)報道,熱應(yīng)激會打破機體內(nèi)活性氧自由基(ROS)的平衡,細(xì)胞大量積累ROS,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的發(fā)生,造成細(xì)胞凋亡損傷[20]。研究發(fā)現(xiàn)改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是膽堿改善乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡的重要分子機制之一[21]。我們推測膽堿對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的保護作用可能也是通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑實現(xiàn)的。因此,本試驗通過熱應(yīng)激誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡,研究膽堿預(yù)處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)下ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響,揭示膽堿抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的分子機制,探索膽堿改善熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)性能的潛力,為生產(chǎn)中預(yù)防熱應(yīng)激對奶牛生產(chǎn)性能的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)細(xì)胞系,由美國哈佛大學(xué)孫毅博士贈送。膽堿購自上海瑞永生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基購自福麥斯生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)購自Gibco公司;BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;Trizol試劑購自Invitrogen公司;CCK-8(A311-01/02)試劑盒購自Vazyme公司;RNA isolater(Trizol)、HiScript?Ⅲ RT SuperMix、AceQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix購自諾唯贊生物科技(南京)有限公司;熱休克蛋白70(HSP70,A12948)購自ABclonal公司;磷酸化PERK(p-PERK,DF7576)購自Affinity公司;蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK,20582-1-AP)、C/EBP同源蛋白(CHOP,15204-AP)、活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF-4,10835-1-AP)、B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2,12789-1-AP)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax,60267-1-Ig)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,10494-1-AP)單克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

在添加10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)MAC-T細(xì)胞,用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1～5 min后制成細(xì)胞懸液,接種于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞密度為5×103mL-1,在光鏡下觀察到細(xì)胞增殖密度達(dá)到70%左右時,改用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h使之生長同步化后,進行隨機分組處理。通過預(yù)試驗分別用0、10、100、1 000、2 000 μmol·L-1的膽堿溶液與MAC-T細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后,于42 ℃水浴中熱處理細(xì)胞2 h,再放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)12 h,根據(jù)細(xì)胞增殖情況選擇最佳膽堿濃度為100 μmol·L-1。將細(xì)胞隨機分為4組:正常對照組(Ctrl組,DMEM/F12完全培養(yǎng)基+10% FBS)、膽堿組(Ch組,含100 μmol·L-1膽堿的DMEM/F12完全培養(yǎng)基)、熱應(yīng)激組(HS組,42 ℃,2 h,DMEM/F12完全培養(yǎng)基+10% FBS)、熱應(yīng)激+膽堿組(HS+Ch組,42 ℃,2 h,含100 μmol·L-1膽堿的DMEM/F12完全培養(yǎng)基)。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并進行以下各項指標(biāo)檢測。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況

細(xì)胞處理結(jié)束后,吸出培養(yǎng)基,PBS洗滌3次(每次5 min)后,每孔加入100 μL CCK-8試劑,于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃孵育4 h,用分光光度計測定吸光值(A450)。每個樣品重復(fù)3次,取平均值。

1.4 ROS熒光染色

在12孔板細(xì)胞爬片上培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞并對細(xì)胞進行處理,用PBS稀釋DEFH-DA,稀釋倍數(shù)為 1∶1 000,上下填倒充分混勻;PBS洗滌細(xì)胞3次,每孔加入300 μL稀釋好的染料,于37 ℃避光孵育 40 min;PBS洗3次,每孔加入DAPI細(xì)胞核染料500 μL,37 ℃避光孵育10 min;PBS洗滌3次,立即上機,在激發(fā)波長為(450±50)nm時用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞,加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液,冰上裂解30 min,每5 min搖勻1次。用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞,12 000 r·min-1離心15 min后,收集上清液,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。加入緩沖液,100 ℃變性10 min,用預(yù)制膠進行電泳分離,結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜,用50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加單克隆抗體(GAPDH、p-PERK、ATF-4、CHOP、Bax、Bcl-2),4 ℃孵育過夜。加二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG)孵育1 h,再用化學(xué)發(fā)光法顯色,用Image J軟件進行條帶的灰度分析。

1.6 RT-qPCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,分光光度計檢測其純度和濃度(1.8

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of real-time qPCR

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激刺激對乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖1所示:對照組細(xì)胞主要呈鋪路石樣分布,細(xì)胞呈梭型,形態(tài)規(guī)整且連接緊密,胞核清晰(圖1-A);當(dāng)細(xì)胞于42 ℃水浴2 h,細(xì)胞呈圓形皺縮明顯,形態(tài)紊亂,少數(shù)細(xì)胞脫壁懸浮,說明奶牛乳腺上皮細(xì)胞受到熱刺激應(yīng)激反應(yīng)明顯(圖1-B)。

圖1 熱應(yīng)激對乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of heat stress on the morphology of mammary epithelial cells A.對照組,細(xì)胞聚集成簇,無空泡現(xiàn)象 Control Group,Cells were clustered into clusters without vacuoles;B.42 ℃水浴2 h,乳腺上皮細(xì)胞呈圓形皺縮Mammary epithelial cells were stimulated for 2 h with a 42 ℃ water bath,and the cells showed a circular shrinkage.

2.2 膽堿處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、10、100、1 000、2 000 μmol·L-1)膽堿處理24 h,結(jié)果如圖2-A所示:隨著膽堿濃度的增加,細(xì)胞活力變化不顯著,說明膽堿藥物處理對奶牛乳腺上皮細(xì)胞毒性不大,不影響其正常的增殖。奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、100、1 000、2 000 μmol·L-1)膽堿預(yù)處理12 h,再于42 ℃水浴處理2 h后,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)12 h。結(jié)果如圖2-B所示:與對照組相比,熱應(yīng)激組的細(xì)胞增殖極顯著降低(P<0.01),當(dāng)膽堿濃度為1 000 μmol·L-1時,細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05)。與熱應(yīng)激組相比,當(dāng)膽堿濃度為10 μmol·L-1時,細(xì)胞增殖顯著增加(P<0.05),當(dāng)膽堿濃度為100 μmol·L-1時,細(xì)胞增殖極顯著增加(P<0.01)。因此,選擇100 μmol·L-1膽堿進行后續(xù)試驗。

圖2 不同濃度膽堿(Ch)對正常培養(yǎng)溫度(37 ℃,A)和熱應(yīng)激下(B)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of choline(Ch)on proliferation of mammary epithelial cells at normal culture temperature of 37 ℃(A)and heat stress(B) Ctrl:對照組Control group;Ch10:Choline 10 μmol·L-1;Ch100:Choline 100 μmol·L-1;Ch1000:Choline 1 000 μmol·L-1;Ch2000:Choline 2 000 μmol·L-1;HS:熱應(yīng)激組Heat stress group,42 ℃,2 h;HS+Ch10:10 μmol·L-1 Choline,42 ℃,2 h;HS+Ch100:100 μmol·L-1 Choline,42 ℃,2 h;HS+Ch1000:1 000 μmol·L-1 Choline,42 ℃,2 h;HS+Ch2000:2 000 μmol·L-1 Choline,42 ℃,2 h. *P<0.05,**P<0.01. 下同The same as follows.

2.3 膽堿處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞HSP70表達(dá)的影響

為了探討膽堿預(yù)處理對熱休克蛋白(HSP)表達(dá)的影響,我們采用RT-qPCR和Western blot法檢測HSP70mRNA和蛋白相對表達(dá)水平。如圖3-A所示:與對照組相比,HS組HSP70mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05),而膽堿預(yù)處理組HSP70mRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。Western blot分析也顯示:與對照組相比,HS組的HSP70蛋白水平顯著上升(P<0.01),而100 μmol·L-1膽堿溶液預(yù)處理則顯著降低了HSP70蛋白表達(dá)水平(P<0.01,圖3-B)。

圖3 膽堿處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞HSP70 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)的影響Fig.3 Effect of choline(ch)pretreatment on the expression of HSP70 mRNA(A)and protein(B) in heat stress-induced bovine mammary epithelial cells

2.4 膽堿處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)含量的影響

本試驗測定了奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ROS含量。結(jié)果(圖4)顯示:與對照組相比,熱應(yīng)激刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞的 ROS陽性含量顯著增加,而用膽堿預(yù)處理的乳腺上皮細(xì)胞的ROS含量顯著降低(P<0.05)。

圖4 膽堿處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)含量的影響Fig.4 Effect of choline pretreatment on the production of reactive oxygen species(ROS) in heat stress-induced bovine mammary epithelial cells

2.5 膽堿處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

采用RT-qPCR檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因GRP78和ATF-4mRNA表達(dá)的結(jié)果如圖5-A所示:與對照組相比,熱應(yīng)激處理后GRP78、ATF-4mRNA表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01),而膽堿預(yù)處理能有效逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(P<0.05)。Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白ATF-4和GRP78的變化情況和PERK磷酸化水平。結(jié)果(圖5-B—F)顯示:膽堿預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)熱應(yīng)激引起的ATF-4蛋白表達(dá)上調(diào),極顯著抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的p-PERK蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。表明膽堿預(yù)處理通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá),抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。

圖5 膽堿預(yù)處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因(A、D)和蛋白(B、C、E、F)表達(dá)的影響Fig.5 Effect of choline pretreatment on heat stress-induced endoplasmic reticulum(ER)stress related gene(A,D) and protein(B,C,E,F)expression in bovine mammary epithelial cells

2.6 膽堿處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞相關(guān)凋亡基因的影響

采用RT-qPCR和Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因CHOP、Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA及蛋白的表達(dá)。如圖6-A所示:與對照組相比,熱應(yīng)激處理后,細(xì)胞中CHOP和Caspase-3mRNA的表達(dá)水平極顯著增加(P<0.01),并極顯著上調(diào)Bax/Bcl-2比值(P<0.01);與熱應(yīng)激組相比,膽堿預(yù)處理能有效抑制CHOP、Caspase-3的表達(dá),下調(diào)Bax/Bcl-2值(P<0.05)。通過Western blot方法檢測CHOP、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激刺激乳腺上皮細(xì)胞顯著上調(diào)CHOP、Bax蛋白水平,抑制Bcl-2蛋白表達(dá),而膽堿預(yù)處理則明顯逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖6-B)。此結(jié)果進一步表明膽堿預(yù)處理能有效抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡損傷。

圖6 膽堿預(yù)處理對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(A)和蛋白(B)表達(dá)的影響Fig.6 Effect of choline pretreatment on the expression of heat stress-induced apoptosis related gene(A)and protein(B)in bovine mammary epithelial cells

3 討論

熱應(yīng)激是指機體對環(huán)境高溫的非特異性反應(yīng),是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要因素之一[22]。研究發(fā)現(xiàn)高溫可降低乳腺上皮細(xì)胞的增殖活性[23]。本試驗發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激會誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生并造成細(xì)胞凋亡損傷,還發(fā)現(xiàn)膽堿預(yù)處理能夠有效緩解熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)是一組響應(yīng)熱應(yīng)激而被激活的蛋白,是熱應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志性蛋白。Cao等[24]對細(xì)胞中HSP家族的免疫功能做了大量研究,對機體內(nèi)免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)的活性進行檢測,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上HSP發(fā)生高表達(dá),能作為抗原誘導(dǎo)機體發(fā)生免疫反應(yīng)。因此,HSP70表達(dá)水平也常被認(rèn)為是判斷細(xì)胞是否處于凋亡損傷的一個重要指標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞受到熱應(yīng)激刺激時,HSP70表達(dá)水平顯著升高,本研究結(jié)果與之相一致,證明了細(xì)胞發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)。

在正常情況下,體內(nèi)ROS的產(chǎn)生、利用和消除保持著動態(tài)平衡。當(dāng)機體處于熱應(yīng)激狀態(tài)時,ROS的積累超過身體的清除能力導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]。本研究結(jié)果表明,與熱應(yīng)激組相比,膽堿預(yù)處理顯著降低了熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞中ROS的積累,表明膽堿預(yù)處理在維持熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中起重要作用。ROS也是誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要因子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種調(diào)控細(xì)胞功能和細(xì)胞存活的細(xì)胞器,對細(xì)胞外環(huán)境的改變非常敏感,其功能紊亂時會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的未折疊及錯誤折疊,并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚和引起Ca2+平衡狀態(tài)的紊亂,稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)[26]。正常狀態(tài)下,葡萄糖結(jié)合蛋白(GRP78)分別與3種跨膜蛋白即PERK、1型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜蛋白激酶(type-1 endoplasmic reticulum transmembrane protein kinase,IRE1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)結(jié)合,呈現(xiàn)無活性狀態(tài)[27];當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時,GRP78和這3種跨膜蛋白解離,轉(zhuǎn)而去結(jié)合并清除未折疊或錯誤的蛋白,誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)的發(fā)生,以激活下游信號的傳遞及相關(guān)基因的表達(dá),緩解ERS狀態(tài),因此GRP78 表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為是發(fā)生ERS標(biāo)志之一[28]。本研究中,熱應(yīng)激刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞后GRP78蛋白及mRNA表達(dá)明顯上調(diào),說明發(fā)生了ERS,這一點與以往研究結(jié)果一致,也證明了本研究通過熱刺激構(gòu)建了奶牛乳腺上皮細(xì)胞ERS模型。PERK作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白,可傳遞應(yīng)激信號。通常情況下PERK與分子伴侶GRP78結(jié)合,而在應(yīng)激時兩者分離,形成PERK同源二聚體,通過磷酸化激活下游通路,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,使細(xì)胞存活[29],上調(diào)ATF4的表達(dá),從而激活介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的CHOP通路,在細(xì)胞損傷不可恢復(fù)的情況下引起細(xì)胞凋亡[30]。CHOP介導(dǎo)的ERS細(xì)胞凋亡途徑是ERS反應(yīng)誘導(dǎo)的3條細(xì)胞凋亡通路中的一條,是UPR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡損傷的主要轉(zhuǎn)錄因子,而CHOP表達(dá)增加也被認(rèn)為是過度ERS的標(biāo)志[31]。

本研究結(jié)果顯示,熱刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞導(dǎo)致ERS反應(yīng)時,PERK信號通路上PERK磷酸化水平顯著升高,也說明熱應(yīng)激誘導(dǎo)的ERS反應(yīng)是通過激活PERK信號通路產(chǎn)生作用的;同時,ERS凋亡相關(guān)蛋白CHOP及ATF 4表達(dá)上調(diào),也說明熱應(yīng)激在誘導(dǎo)ERS反應(yīng)時,PERK信號通路誘導(dǎo)CHOP合成,激活了細(xì)胞凋亡通路[32],從而引起細(xì)胞凋亡損傷,進一步說明熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號通路PERK/ATF-4/CHOP造成的。

為了進一步闡明膽堿對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用機制,通過RT-qPCR和Western blot 檢測100 μmol·L-1膽堿預(yù)處理后PERK磷酸化水平和GRP78、ATF-4表達(dá),發(fā)現(xiàn)膽堿預(yù)處理可顯著下調(diào) p-PERK、GRP78和ATF-4表達(dá)水平,說明膽堿能有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生;進一步檢測凋亡相關(guān)基因和蛋白CHOP、Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)100 μmol·L-1膽堿預(yù)處理能明顯抑制CHOP、Bax和Caspase-3表達(dá),顯著上調(diào)Bcl-2表達(dá),說明膽堿預(yù)處理能有效減緩熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡損傷。

綜上,本研究結(jié)果證明,熱應(yīng)激可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加,進而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并激活PERK/ATF-4/CHOP信號通路,繼而激活了細(xì)胞凋亡通路,從而造成細(xì)胞凋亡損傷。而膽堿預(yù)處理則顯著抑制了上述現(xiàn)象。進一步證明膽堿預(yù)處理能有效減緩熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡損傷,揭示了膽堿通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,調(diào)控PERK/ATF-4/CHOP信號通路的表達(dá)水平,減緩熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞凋亡。