8 個(gè)雜交水稻新組合種子純度的分子標(biāo)記鑒定

蔣鈺東 何茹薇 羅俊濤 楊 揚(yáng) 鄭 軍 付 均 曾正明

（1 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所/農(nóng)業(yè)部西南水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，德陽(yáng) 618000；2 國(guó)家水稻改良中心四川瀘州分中心，瀘州 646100）

水稻是我國(guó)最重要的糧食作物之一，我國(guó)約有65%的人口以稻米為主食，因此保障水稻的正常生產(chǎn)對(duì)我國(guó)糧食安全有著重要作用。目前我國(guó)水稻常年種植面積維持在3000 萬(wàn)hm2，雜交水稻占我國(guó)水稻種植面積的55%左右，雜交水稻比常規(guī)水稻品種產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)明顯，一般可增產(chǎn)20%左右，優(yōu)勢(shì)品種增產(chǎn)幅度更大，雜交水稻的應(yīng)用和推廣使得我國(guó)水稻單產(chǎn)大幅度提高，對(duì)保障我國(guó)水稻生產(chǎn)具有重要貢獻(xiàn)[1]。雜交種純度的高低直接影響雜交水稻的種子質(zhì)量，種子質(zhì)量是決定水稻大田生產(chǎn)中產(chǎn)量表現(xiàn)的關(guān)鍵，也是決定種子公司生產(chǎn)的產(chǎn)品在市場(chǎng)上具備強(qiáng)大競(jìng)爭(zhēng)力的重要因素，是種子公司安身立命之本。檢驗(yàn)雜交種子的純度是每個(gè)種子公司將雜交種子推向市場(chǎng)前的必要環(huán)節(jié)[2]。目前田間種植鑒定種子純度是最為普遍的檢驗(yàn)方法，主要通過(guò)在海南加代種植或正季種植期間，對(duì)水稻進(jìn)行全生育進(jìn)程的農(nóng)藝性狀觀察，比對(duì)各單株間的典型性狀，通過(guò)品種的農(nóng)藝特征特性鑒別真實(shí)雜交種及雜株[3]。海南種植鑒定有時(shí)間相對(duì)提前的優(yōu)勢(shì)，在當(dāng)年冬季就能鑒定出純度結(jié)果，但在海南冬季短日照低溫的條件下，對(duì)感光類型的雜交水稻品種的鑒定結(jié)果往往不太準(zhǔn)確。正季種植鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度高，但時(shí)間明顯滯后，從生產(chǎn)上重大種子純度事故來(lái)看，當(dāng)?shù)弥N子純度不合格時(shí)，種子已流入市場(chǎng)，損失也已無(wú)法挽回。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，SSR分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于雜交種子的純度鑒定中，SSR 標(biāo)記是在水稻分子層面上鑒定，主要是利用不同水稻品種遺傳組成不同，基因組DNA 中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)有差異。通過(guò)PCR 擴(kuò)增及電泳方法檢測(cè)出差異，從而能夠?qū)⒉煌贩N精準(zhǔn)區(qū)分。SSR 標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳上呈共顯性、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)[4]。

本研究利用SSR 標(biāo)記技術(shù)對(duì)新配制雜交組合的雙親進(jìn)行多態(tài)性篩選，分別篩選出在雙親之間顯示出良好多態(tài)性的引物，然后對(duì)雜交種子進(jìn)行純度鑒定，同時(shí)進(jìn)行田間種植鑒定，兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較來(lái)驗(yàn)證SSR 標(biāo)記檢測(cè)8 個(gè)雜交組合種子純度的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料親本不育系為新育三系不育系6026A。親本恢復(fù)系共計(jì)8 份：德恢6099、旌香占、粵禾絲苗、德恢5292、瀘恢1611、R2195、R5004和R4149。

8 個(gè)雜交水稻新組合：6026A/德恢6099、6026A/旌香占、6026A/粵禾絲苗、6026A/德恢5292、6026A/瀘恢1611、6026A/R2195、6026A/R5004、6026A/R4149。試驗(yàn)所用種子均是2020 年夏季新生產(chǎn)的雜交水稻種子。

1.2 基因組DNA 提取和檢測(cè)采用簡(jiǎn)易CTAB法[5]提取水稻嫩葉片總DNA，并利用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)提取DNA 樣品濃度和質(zhì)量。利用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3 篩選引物利用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 標(biāo)記法》中的48 對(duì)引物進(jìn)行雙親多態(tài)性檢測(cè)，引物由擎科生物科技有限公司合成。選用各組合多態(tài)性標(biāo)記用于后續(xù)雜交稻種子純度檢測(cè)。

1.4 SSR 標(biāo)記鑒別種子純度利用雙親間具有多態(tài)性的SSR 引物，對(duì)200 株雜交種幼苗進(jìn)行純度鑒定，盡量選擇2 對(duì)SSR 引物進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增帶型與標(biāo)準(zhǔn)帶型不一致時(shí)，判定其為雜株。統(tǒng)計(jì)父本、母本和雜種種子數(shù)占被測(cè)種子數(shù)的比例。

1.5 田間種植鑒定種子純度每個(gè)組合在海南田間分別種植200 株，單本栽插，栽插規(guī)格16.5cm×26.4cm。在整個(gè)生長(zhǎng)階段觀察品種的特征特性，控制化肥和除草劑的使用劑量，以免影響植株本身的特征特性。在抽穗前及齊穗后依據(jù)GB/T 3543.5—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定》進(jìn)行田間純度鑒定，根據(jù)品種特征特性對(duì)明顯雜株及可疑植株用掐葉的方法進(jìn)行標(biāo)記，并詳細(xì)記錄下雜株類型和數(shù)量[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交組合引物篩選由表1 可知，經(jīng)過(guò)對(duì)雙親間引物多態(tài)性篩選，在6026A/德恢6099 親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物有RM208、RM232、RM17、RM493、RM2877、RM21 和RM3331；在6026A/德恢5292 親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物有RM19、RM274；在6026A/R2195 親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物有RM219、RM19；在6026A/R5004 親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物有RM311、RM19；在6026A/瀘恢1611親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物有RM71、RM19；在6026A/旌香占親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物有RM17、RM432；在6026A/R4149 親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物僅有RM17；在6026A/粵禾絲苗親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物有RM274、RM201、RM232。

表1 雜交稻組合及可用于純度鑒定的SSR 標(biāo)記

2.2 利用SSR 標(biāo)記的雜交種純度檢測(cè)分別選取8 個(gè)雜交組合F1中的200 個(gè)單株，利用在6026A/德恢6099 雙親表現(xiàn)為多態(tài)性的2 個(gè)SSR 標(biāo)記（RM208 和RM17）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有195 個(gè)單株在2 個(gè)標(biāo)記座位上均呈現(xiàn)為雙親的互補(bǔ)帶型，可判斷為真實(shí)的6026A/德恢6099 F1種子，余下5 個(gè)單株在其中1 個(gè)標(biāo)記座位上（RM17）呈現(xiàn)為雙親的互補(bǔ)帶型，但在另外1 個(gè)座位上（RM208）表現(xiàn)為德恢6099 純合型，說(shuō)明該單株為混雜的其他雜合型材料（圖1，表2）。利用6026A/德恢5292 雙親表現(xiàn)為多態(tài)性的2 個(gè)SSR 標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有6個(gè)單株在2 個(gè)座位上（RM19 和RM274）表現(xiàn)為其他類型，其余194 個(gè)單株在此2 個(gè)座位上均呈現(xiàn)雙親的互補(bǔ)帶型；利用6026A/R2195 雙親表現(xiàn)為多態(tài)性的2 個(gè)位點(diǎn)（RM219 和RM19）進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有12 個(gè)單株在2 個(gè)座位上表現(xiàn)為其他型，其余188 個(gè)單株在此2 個(gè)座位上均呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型；利用6026A/R5004 雙親表現(xiàn)為多態(tài)性的2 個(gè)位點(diǎn)（RM311 和RM19）進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，27 個(gè)單株在2 個(gè)座位上表現(xiàn)為其他型，其余173 個(gè)單株均呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型；利用6026A/瀘恢1611 雙親表現(xiàn)為多態(tài)性的2 個(gè)位點(diǎn)（RM71 和RM19）進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有8 個(gè)單株在2 個(gè)座位上表現(xiàn)為其他型；利用6026A/旌香占在RM17 和RM432 位點(diǎn)上表現(xiàn)為多態(tài)性，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5 個(gè)單株在2 個(gè)座位上表現(xiàn)為其他型；利用6026A/R4149 僅在RM17 位點(diǎn)上表現(xiàn)為多態(tài)性，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅有3 個(gè)單株表現(xiàn)為其他型，其他單株表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)帶型；利用6026A/粵禾絲苗在RM274 和RM201 位點(diǎn)上表現(xiàn)為多態(tài)性，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)7 個(gè)單株表現(xiàn)為其他型，193 個(gè)單株呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型。

表2 雜交水稻種子SSR 純度鑒定結(jié)果

圖1 標(biāo)記RM17 對(duì)6026A 和德恢6099及其雜交種純度檢測(cè)

2.3 田間種植鑒定結(jié)果同年冬季在海南基地種植各雜交組合200 個(gè)單株進(jìn)行田間觀察，從表3 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜交組合6026A/R5004 發(fā)現(xiàn)3 株相近異形株，其生育期、植株形態(tài)與鑒定組合相似，只是葉邊緣、葉鞘顏色和粒寬上有明顯不同。其次，發(fā)現(xiàn)每個(gè)組合都有不同程度雜株，6026A/德恢6099與6026A/旌香占雜株類型主要表現(xiàn)為植株矮、生育期早以及完全不同形態(tài)的植株（疑是制種田飛花所致）；6026A/瀘恢1611 和6026A/粵禾絲苗雜株類型主要表現(xiàn)為抽穗期遲、高株、株型差異大等；6026A/R2195、6026A/德恢5292 和6026A/R4149的雜株類型主要表現(xiàn)為株葉形態(tài)和籽粒性狀上的差異。8 個(gè)組合中，田間純度最好的是6026A/德恢6099，為95.5%；最差的為6026A/R5004，僅為81.5%，但所有組合的純度整體還是較差，均達(dá)不到雜交稻96%的純度標(biāo)準(zhǔn)。

表3 試驗(yàn)組合抽穗期及田間純度結(jié)果

2.4 SSR 鑒定與田間種植鑒定結(jié)果對(duì)比比較表2 和表3 可以看出，SSR 鑒定與田間鑒定結(jié)果比較接近，差值范圍2%～7%，各雜交組合田間種植純度鑒定與SSR 鑒定純度的趨勢(shì)是一致的，而SSR 鑒定純度結(jié)果比田間鑒定結(jié)果數(shù)值高（圖2）。

圖2 SSR 鑒定與田間鑒定的種子純度對(duì)比

3 討論

傳統(tǒng)的種子純度鑒定方法主要是田間種植觀察鑒定，而田間種植鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確性受到鑒定者的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)、田間栽培管理水平、天氣環(huán)境等因素影響[7]。隨著DNA 分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，SSR 標(biāo)記檢測(cè)快速高效的優(yōu)勢(shì)使其在雜交水稻種子純度鑒定中越來(lái)越廣泛使用[8]。眾多研究結(jié)果表明，SSR 標(biāo)記檢測(cè)與田間鑒定種子純度均有一定差異，這種差異變化呈無(wú)規(guī)律性，主要因?yàn)镾SR 鑒定針對(duì)單一的不育系、恢復(fù)系和混入的常規(guī)品種可以準(zhǔn)確區(qū)分，但對(duì)于部分串粉混雜和變異株不容易區(qū)分，主要因?yàn)樘镩g串粉混雜造成的雜株類型很復(fù)雜，部分雜株類型在單個(gè)SSR 標(biāo)記可能沒(méi)有表現(xiàn)出多態(tài)性，此外SSR 鑒定的準(zhǔn)確性還受到DNA 提取質(zhì)量、電泳操作和引物的影響；另一方面是因?yàn)樘镩g種植鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確性受到鑒定者的經(jīng)驗(yàn)、栽培管理、環(huán)境條件等因素干擾[9]。總體結(jié)果比較，SSR 標(biāo)記檢測(cè)和田間鑒定結(jié)果趨勢(shì)相同，差異幅度較小[10]。對(duì)于現(xiàn)代種企而言，可以利用室內(nèi)和田間鑒定相結(jié)合的方式，快速、精準(zhǔn)、高效地鑒定雜交種子純度，以保證推向市場(chǎng)種子的質(zhì)量[11]。

本研究利用SSR 標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)新配制的8 個(gè)雜交組合的種子純度，并同田間鑒定結(jié)果相比較。研究結(jié)果表明，利用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 標(biāo)記法》中48 對(duì)標(biāo)記，篩選出8 個(gè)雜交組合的共顯性標(biāo)記鑒定各雜交組合種子純度，SSR 標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示各組合的種子純度在86.5%～98.5%之間，種子純度比海南田間鑒定結(jié)果稍高，這種情況有可能是樣本數(shù)或SSR 標(biāo)記數(shù)較少的原因。整體而言，2 種方法鑒定結(jié)果較為相近，說(shuō)明利用SSR 標(biāo)記檢測(cè)雜交組合種子純度是可行的。因此，為保證雜交稻種子純度，一是擴(kuò)大樣本量，二是選擇多個(gè)共顯性標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，但考慮成本及檢測(cè)時(shí)間，應(yīng)至少選取2 對(duì)及以上共顯性標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)2 個(gè)標(biāo)記檢測(cè)純度一致時(shí)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本研究通過(guò)利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出可利用的共顯性標(biāo)記，形成了一套準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單的鑒定雜交種純度的技術(shù)體系，對(duì)新配制的8 個(gè)雜交組合種子純度進(jìn)行了快速鑒定，加快了育種工作進(jìn)程。