酸性環(huán)境對腎小管上皮細(xì)胞自噬-溶酶體通路的影響

陳小翠，李志航，楊陳，劉華鋒

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病研究所 湛江市慢性腎臟病防治重點實驗室，廣東 湛江 524001)

腎臟是維持機體酸堿電解質(zhì)平衡的重要器官之一。慢性腎臟病常引起酸堿電解質(zhì)紊亂，腎臟泌酸功能受限，引起代謝性酸中毒[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，代謝性酸中毒所引起的小管腔內(nèi)低pH酸性環(huán)境可以多種途徑直接誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞(tubular epithelial cell，TEC)功能異常。酸性環(huán)境可使殘余TEC產(chǎn)氨作用增強，促使細(xì)胞肥大和增生；通過旁路途徑激活補體系統(tǒng)，持續(xù)損傷TEC；通過激活富含脯氨酸的酪氨酸激酶2，引起TEC內(nèi)活性氧類產(chǎn)生增多，損傷小管；增大TEC線粒體負(fù)荷壓力，持續(xù)刺激下會引起線粒體膜電位丟失，導(dǎo)致細(xì)胞能量系統(tǒng)無法維持[3]。

自噬溶酶體系統(tǒng)是重要的自我保護機制之一，對維持細(xì)胞的穩(wěn)定至關(guān)重要[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)孢素腎毒模型[5]、順鉑腎毒模型[6-7]和膿毒血癥腎毒模型[8]以及單側(cè)腎梗阻模型[9]和腎缺血再灌注損傷模型[10]中均存在TEC自噬誘導(dǎo)現(xiàn)象，而自噬具有保護TEC、抵抗危險因素?fù)p傷的作用。此外，自噬激活在蛋白尿和晚期糖基化終末產(chǎn)物所致的TEC損傷過程中也發(fā)揮重要的保護作用[11-12]。目前酸性環(huán)境下自噬-溶酶體系統(tǒng)是否作為一種保護機制被激活尚不清楚。本研究旨在通過體外實驗探討代謝性酸中毒所致酸性環(huán)境對TEC自噬-溶酶體的影響，以進(jìn)一步探求酸性環(huán)境導(dǎo)致TEC損傷的潛在機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和試劑 人TEC(HK-2)細(xì)胞株(美國ATCC公司生產(chǎn)，批號：63848926)購自美國模式菌種收集中心。含1%青霉素-鏈霉素雙抗(批號：1970741)、10%胎牛血清(批號：2176404)、杜爾貝科改良伊格爾完全培養(yǎng)基(批號：8120469)均購自美國Gibco公司。鹽酸(批號：1098214)、anti-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅱ(批號：0000090954)均購自美國Sigma公司。四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)試劑盒(批號：053320200806)、含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(批號：051020202825)、RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液(批號：042121200708)、辣根過氧化物酶結(jié)合的抗小鼠IgG和抗兔IgG(批號：112120200408、112020200305)均購自上海碧云天公司。蛋白酶-磷酸酶抑制劑(批號：2020A1CP1260)購自北京普利萊公司。BCA(Bicinchoninic Acid Assay)蛋白檢測試劑盒(批號：RL242683)購自美國Thermo Fisher公司。乙烯膜(批號：R1BB12933)購自美國EMD Millipore公司。ECL(ClarityTMWestern ECL)化學(xué)發(fā)光液(批號：P10026378)購自美國Bio-Rad公司。anti-p62/SQSTM1(批號：GR33369111-1)購自美國Abcam公司，anti-β-肌動蛋白(β-actin)(批號：K2818)購自美國Santa Cruz公司，anti-轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)(批號：lot3)購自美國Bethyl Laboratories公司。串聯(lián)熒光蛋白質(zhì)粒tfGal3(RFP and GFP tandem fluorescent tagged Galectin-3 probe，批號：639013)購自美國 Addgene公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(批號：1831599)購自美國Invitrogen公司。牛血清白蛋白溶液(批號：AR0004)購自美國BOSTER公司。

1.1.2儀器 pH儀(型號：FE28型)購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)，酶標(biāo)儀(型號：Elx800型)購自美國Biotek公司，0.22 μm過濾器(型號：ROKB83855)購自德國Millipore公司，Azure C500 Western Blot成像系統(tǒng)(型號：50043)購自美國Azure biosystems。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 在含1%青霉素-鏈霉素雙抗的10%胎牛血清杜爾貝科改良伊格爾完全培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及正常消化傳代。采用pH儀檢測，利用鹽酸將含10%胎牛血清的杜爾貝科改良伊格爾完全培養(yǎng)基的pH值調(diào)至7.4、7.0、6.6及6.2，且培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm過濾器過濾除菌后使用，每次現(xiàn)用現(xiàn)配。利用不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞24 h后獲得的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。利用蛋白免疫印跡檢測溶酶體新生關(guān)鍵TFEB。

1.2.2細(xì)胞活力檢測 利用MTT試劑盒檢測不同pH培養(yǎng)基對細(xì)胞增殖及毒性的影響。按每孔5 000個細(xì)胞在96孔板上種植HK-2細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，換不同pH培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照試劑盒要求，每孔加入10 μl的MTT溶液37 ℃孵育繼續(xù)4 h后，每孔加入100 μl二甲基亞砜溶解液再繼續(xù)孵育，直至全部溶解。利用酶標(biāo)儀在570 nm檢測各孔的光吸收值，進(jìn)行3次獨立重復(fù)實驗。

1.2.3蛋白免疫印跡檢測 利用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟和蛋白酶-磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取HK-2細(xì)胞的總蛋白。裂解液于4 ℃、13 000×g離心15 min，取上清液；利用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白標(biāo)本加入蛋白免疫印跡上樣緩沖液經(jīng)加熱處理后，行12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離；然后將膠上蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上。聚偏氟乙烯膜經(jīng)含5%牛血清白蛋白的磷酸鹽-吐溫20緩沖溶液室溫封閉1 h后，加入稀釋至合適濃度的一抗試劑，于4 ℃孵育過夜。次日經(jīng)清洗后，將聚偏氟乙烯膜膜與結(jié)合辣根過氧化物酶的二抗共同在室溫條件下孵育2 h。再次清洗后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，底物顯色。利用Azure C500 Western Blot成像系統(tǒng)捕獲信號，并用Image J軟件(美國NIH)分析結(jié)果。進(jìn)行4次獨立重復(fù)實驗。

1.2.4溶酶體損傷檢測 利用串聯(lián)熒光蛋白質(zhì)粒tfGal3檢測溶酶體破裂情況[13]。根據(jù)說明書，利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒，將2 μg/ml tfGal3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，而后細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)刺激。收集細(xì)胞后，于Leica激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號并拍照，利用Photoshop軟件分析細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的數(shù)量。

2 結(jié)果

2.14組HK-2細(xì)胞活力比較 pH 7.4組、pH 7.0組、pH 6.6組、pH 6.2組HK-2細(xì)胞活力分別為(100.00±9.59)%、(96.30±7.85)%、(87.69±9.91)%、(75.06±9.62)%，各組HK-2細(xì)胞活力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.109，P<0.001)。pH 6.6組和pH 6.2組HK-2細(xì)胞活力明顯低于pH 7.4組(P=0.011、P<0.001)，pH 6.2組HK-2細(xì)胞活力低于pH 7.0組(P<0.001)，其他兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.24組HK-2細(xì)胞LC3-Ⅱ、p62表達(dá)水平比較 各組HK-2細(xì)胞LC3-Ⅱ、p62表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與pH 7.4組相比，pH 7.0組HK-2細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高(P=0.008)，pH 6.2組LC3-Ⅱ 表達(dá)水平低于pH 7.0組和pH 6.6組(P=0.002、P=0.016)，其他兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與pH 7.4組相比，pH 7.0組和pH 6.6組HK-2細(xì)胞p62表達(dá)水平均明顯降低(P=0.001、P=0.001)，pH6.2組高于pH 7.0組和pH 6.6組(P=0.002、P=0.002)，其他兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 4組HK-2細(xì)胞LC3-Ⅱ與p62表達(dá)水平比較

2.34組HK-2細(xì)胞溶酶體結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)比較 與pH 7.4組相比，pH 7.0組HK-2細(xì)胞內(nèi)黃色熒光顆粒和紅色熒光顆粒均略升高；與pH 7.4組和pH 7.0組相比，pH 6.6組HK-2細(xì)胞內(nèi)黃色熒光顆粒和紅色熒光顆粒顯著增多，且黃色熒光顆粒 /紅色熒光顆粒比例增加，但損傷溶酶體仍可通過自噬依賴途徑進(jìn)行降解；與pH 7.4組、pH 7.0組、pH 6.6組相比，pH 6.2組HK-2細(xì)胞內(nèi)黃色熒光顆粒增多，呈片狀存在，紅色熒光顆粒幾乎完全消失，見圖2。

注：LC3為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3，β-actin為β-肌動蛋白

2.44組HK-2細(xì)胞TFEB表達(dá)情況比較 pH 7.4組、pH 7.0組、pH 6.6組、pH 6.2組HK-2細(xì)胞內(nèi)TFEB倍數(shù)變化分別為(1.00±0.03)、(1.04±0.07)、(0.84±0.16)、(0.77±0.10)，4組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.540，P<0.001)，與pH 7.4組相比，pH 6.6組和pH 6.2組HK-2細(xì)胞內(nèi)TFEB表達(dá)水平均明顯降低(P=0.016、P=0.001)，pH 7.4組與pH 7.0組HK-2細(xì)胞內(nèi)TFEB表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.904)；與pH 7.0組相比，pH 6.6組和pH 6.2組TFEB表達(dá)水平亦明顯低于(P=0.003、P<0.001)，pH 6.6組和pH 6.2組TFEB表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.584)。見圖3。

注：GFP為綠色熒光蛋白，mRFP為單體紅色熒光蛋白，Gal3為半乳糖凝集素3，Merge為合并；黃色熒光顆粒代表破裂受損的溶酶體，紅色熒光顆粒代表通過自噬依賴途經(jīng)在被清除的溶酶體

注：TFEB為轉(zhuǎn)錄因子EB，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶

3 討 論

組織局部酸化是多種慢性炎癥性疾病的主要表現(xiàn)，包括缺血、動脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎臟病等。既往關(guān)于酸性環(huán)境對浸潤的中心粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞影響的研究較多，對類似腎臟固有細(xì)胞的作用分子機制研究較少。線粒體是TEC關(guān)鍵的細(xì)胞器之一，其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定對于高耗能TEC至關(guān)重要[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境可以誘導(dǎo)TEC內(nèi)線粒體呈現(xiàn)碎片化，即線粒體分裂增多而融合減少[15]；呈現(xiàn)碎片化的線粒體可以通過Drp1介導(dǎo)的途徑激活線粒體特異性自噬，以清除碎片化的線粒體，維持整體線粒體功能的穩(wěn)定[16]。既往研究中，氯化銨模擬酸性環(huán)境刺激TEC，可誘導(dǎo)TEC發(fā)生自噬，清除受損的線粒體，降解堆積的泛素化蛋白[17]。可見，輕微的細(xì)胞酸性環(huán)境激活細(xì)胞自噬起保護作用。本研究結(jié)果顯示，隨著酸性程度的增強，自噬通路先呈現(xiàn)活化(表現(xiàn)為自噬體蛋白LC3-Ⅱ上升而底物p62下降)；而隨著酸性程度進(jìn)一步增強，自噬-溶酶體通路可能受到抑制(表現(xiàn)為LC3-Ⅱ、p62恢復(fù)，且與pH 7.4組比較無明顯差異，而細(xì)胞活力顯著下降)。因此，培養(yǎng)基環(huán)境對HK-2細(xì)胞自噬-溶酶體通路變化呈酸性程度依賴性，隨著酸性程度的增強，細(xì)胞自噬的保護機制逐漸喪失，細(xì)胞活力明顯下降。

自噬通路活性依賴于自噬體的形成以及溶酶體對自噬體的有效降解，因此，隨著酸性環(huán)境加劇而引起的自噬通路障礙可能與溶酶體結(jié)構(gòu)和功能受到干擾有關(guān)[18]。有文獻(xiàn)報道，酸性環(huán)境可引起乳腺癌細(xì)胞[19]和前列腺癌細(xì)胞[20]溶酶體的腫脹、數(shù)量減少、細(xì)胞內(nèi)外周化。在腎臟固有細(xì)胞研究方面，應(yīng)用NH4Cl模擬酸性刺激可顯著上調(diào)腎臟系膜細(xì)胞[21]和TEC內(nèi)溶酶體pH值[22]，抑制溶酶體組蛋白酶B和蛋白酶L的活性，抑制蛋白降解，從而促進(jìn)細(xì)胞肥大。通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，NH4Cl誘導(dǎo)的代謝性酸中毒大鼠模型分離純化的TEC內(nèi)，溶酶體組蛋白酶B的蛋白表達(dá)明顯降低[23]。在本研究中，利用轉(zhuǎn)染tfGal3的HK-2細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞外環(huán)境的不斷酸化，HK-2細(xì)胞內(nèi)溶酶體逐漸出現(xiàn)膜透化。這種溶酶體的膜透化會引起腔內(nèi)pH值升高，溶酶體酶活性下降甚至降解能力的削弱，從而影響自噬體的降解，導(dǎo)致自噬保護作用喪失。既往研究報道，尿蛋白[24]和晚期糖基化終末產(chǎn)物[25]可以通過誘導(dǎo)溶酶體發(fā)生膜透化，抑制自噬體降解，造成自噬通路阻滯，最終導(dǎo)致TEC損傷。半乳糖凝集素3是一種β-半乳糖苷結(jié)合凝集素，廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。當(dāng)溶酶體發(fā)生膜通透化時，串聯(lián)熒光蛋白的半乳糖凝集素3迅速浸潤至破裂的溶酶體囊腔中，并與β-半乳糖苷富集的溶酶體內(nèi)膜結(jié)合，表現(xiàn)為黃色熒光顆粒(即綠色熒光和紅色熒光雙陽性)。損傷的溶酶體可被選擇性地包裹入自噬體，與剩余的、有功能的溶酶體結(jié)合，從而被降解，此過程被稱為溶酶體自噬[26]。在溶酶體自噬過程中，綠色熒光由于溶酶體的酸性環(huán)境而淬滅，紅色熒光因耐受酸性環(huán)境而持續(xù)存在，因此在共聚焦顯微鏡下，黃色熒光顆粒變成紅色熒光單獨陽性顆粒。

TFEB是調(diào)控溶酶體穩(wěn)定和自噬通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。溶酶體結(jié)構(gòu)完整和功能正常時，TFEB被磷酸化?？吭谌苊阁w膜上；一旦溶酶體發(fā)生膜透化等損傷，TFEB脫磷酸化，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，啟動溶酶體相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)溶酶體新生和溶酶體穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)[27]。在疾病狀態(tài)下，TFEB的活性或表達(dá)受到抑制，則引起溶酶體穩(wěn)態(tài)異常。本研究中，酸性環(huán)境引起TFEB的表達(dá)下降可能是酸性環(huán)境導(dǎo)致自噬-溶酶體通路異常的主要原因。

本研究中，pH 6.2組HK-2細(xì)胞內(nèi)并未出現(xiàn)明顯的自噬底物堆積，這與既往在糖尿病腎病狀態(tài)下TEC的損傷表現(xiàn)不同[25]。嚴(yán)重的酸性環(huán)境可能同時影響自噬體的形成，所以未出現(xiàn)明顯的自噬底物堆積現(xiàn)象(p62表達(dá)增多)，但這一推斷需要后續(xù)進(jìn)一步研究的證實。本研究缺少體內(nèi)實驗證據(jù)，故仍需后續(xù)研究完善。

綜上所述，細(xì)胞外酸性環(huán)境可能通過干擾自噬-溶酶體通路導(dǎo)致TEC活力下降。