基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討紅花-黃芪治療原發(fā)性膽汁性膽管炎的可能性

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以肝內(nèi)膽汁淤積為特征的自身免疫性炎癥性疾病

。亞太地區(qū)PBC的總流行率為118.75/百萬(wàn)人，其5年累計(jì)肝硬化失代償、肝細(xì)胞癌和死亡/肝移植發(fā)生率分別為6.95%、1.54%和4.02%

。目前，對(duì)于PBC的治療以熊去氧膽酸(UDCA)為一線治療，但仍有1/3～2/5的患者對(duì)UDCA應(yīng)答欠佳，對(duì)這部分人群以?shī)W貝膽酸作為二線治療

。中醫(yī)學(xué)歷史悠久，且中醫(yī)藥具有成分多、作用靶點(diǎn)多的特點(diǎn)，對(duì)于PBC的治療中醫(yī)藥可能是有效的方式之一。中醫(yī)學(xué)將PBC歸為“黃疸”、“脅痛”、“積聚”、“臌脹”、“風(fēng)瘙癢”等范疇。本病多因先天稟賦不足、外感濕熱、飲食不節(jié)、情志不暢、勞倦過(guò)度或久病傷正有關(guān)，肝脾腎虧虛、臟腑功能失調(diào)為本病病機(jī)

。其病性屬本虛標(biāo)實(shí)，以肝脾腎虛為本，但本虛存在“氣虛”、“腎虛”、“陰血虛”等多種看法，“濕熱”、“氣滯”、“血瘀”為疾病之標(biāo)

?！端貑?wèn)》有言“人之所有者，氣與血耳”、“氣血不和，百病乃變化而生”，氣血是人體的物質(zhì)基礎(chǔ)，氣血失調(diào)則生病。而PBC的發(fā)病以“虛”為本，“瘀”是疾病發(fā)展到一定階段的產(chǎn)物。紅花具活血行氣化瘀之效，黃芪為補(bǔ)氣之品，取其補(bǔ)氣行血、生津養(yǎng)血之功。針對(duì)PBC患者，兩藥同用共奏補(bǔ)氣虛、陰血虛之本，兼活血理氣化瘀而治其氣滯血瘀之標(biāo)。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從“瘀”和“虛”兩方面來(lái)探究紅花-黃芪治療PBC的可能性。

1 資料與方法

1.1 紅花-黃芪活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索“紅花”、“黃芪”得到其有效成分及作用靶點(diǎn)，通過(guò)設(shè)置生物利用度≥30%和類藥性≥0.18篩選紅花和黃芪的優(yōu)效活性成分，應(yīng)用uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的人類基因名稱。

1.2 PBC相關(guān)靶基因的獲取 應(yīng)用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)，設(shè)置檢索詞“primary biliary cirrhosis”，獲取PBC的疾病靶點(diǎn)。

1.3 紅花-黃芪與PBC交集靶點(diǎn)的提取及維恩圖繪制 將紅花-黃芪的藥物作用靶點(diǎn)與PBC的疾病靶點(diǎn)取交集，并應(yīng)用R軟件的VennDiagram安裝包繪制紅花-黃芪與PBC交集靶點(diǎn)的維恩圖。

1)某臺(tái)發(fā)動(dòng)機(jī)在給定時(shí)間點(diǎn)Time的實(shí)時(shí)裝配數(shù)據(jù)RD和完整數(shù)據(jù)D,由定義4和定義5可知，RD=V(Time)，D=U(Time)。

1.4 紅花-黃芪與PBC的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 應(yīng)用紅花-黃芪的藥物作用靶點(diǎn)與PBC的疾病靶點(diǎn)取交集后的基因，在cytoscape3.8.0平臺(tái)構(gòu)建紅花-黃芪與PBC的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及其關(guān)鍵蛋白節(jié)點(diǎn)條形圖繪制 應(yīng)用String平臺(tái)(https://string-db.org/)，通過(guò)紅花-黃芪與PBC取交集后的作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)、設(shè)置物種為人、最低相互作用閾值為0.4、隱藏游離蛋白、其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)定從而構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，保存圖形及下載PPI相互作用數(shù)據(jù)文件，應(yīng)用R軟件選擇節(jié)點(diǎn)靠前的30個(gè)基因繪制PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白節(jié)點(diǎn)條形圖。

2.1 紅花-黃芪活性成分及作用靶點(diǎn) 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)篩選得到滿足條件的紅花、黃芪共44個(gè)優(yōu)效活性成分，其中紅花的優(yōu)效活性成分22個(gè)，黃芪的優(yōu)效活性成分20個(gè)，表1列舉紅花-黃芪部分優(yōu)效活性成分。紅花對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)449個(gè)，黃芪對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)462個(gè)，應(yīng)用uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將其轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的人類基因名稱，得到紅花的靶基因218個(gè)，黃芪的靶基因209個(gè)。

2.3 紅花-黃芪與PBC的交集靶點(diǎn) 將獲得的3 189個(gè)PBC相關(guān)疾病靶點(diǎn)與紅花和黃芪靶基因取交集，得到紅花-黃芪與PBC的交集靶基因81個(gè)并繪制維恩圖(圖1)。

2 結(jié)果

丁小強(qiáng)對(duì)布雅蘭的生活沒(méi)有好奇心。正因?yàn)檫@樣，所以他才沒(méi)有掛礙地讀取了這條短信。沒(méi)有發(fā)件人的姓名，只有一串?dāng)?shù)字，短信非常簡(jiǎn)單明了，只有七個(gè)字：夢(mèng)到了，一起打牌。

2.4 紅花-黃芪與PBC的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將紅花-黃芪與PBC的81個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。結(jié)果顯示，紅花和黃芪分別有14種和15種藥效成分協(xié)同作用于PBC的疾病靶點(diǎn)，其中以來(lái)自紅花和黃芪的共有藥效成分槲皮素作用于PBC的靶點(diǎn)最多，達(dá)61個(gè)，其次為來(lái)自紅花的木犀草素和紅花、黃芪共有成分山萘酚作用靶點(diǎn)較多，均為25個(gè)。其中，作用于PBC較多的前三靶點(diǎn)依次為前列腺素-環(huán)氧合酶1(PTGS1)、絲氨酸蛋白酶1(PRSS1)和雄激素受體(AR)，分別有18種、14種和11種藥效成分。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及其關(guān)鍵蛋白節(jié)點(diǎn)條形圖繪制 將紅花-黃芪與PBC取交集后的81個(gè)作用靶點(diǎn)在String平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)，通過(guò)R軟件繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白節(jié)點(diǎn)條形圖(圖4)。結(jié)果顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)中有79個(gè)蛋白可發(fā)生相互作用，另外2個(gè)靶蛋白未發(fā)生蛋白相互作用。圖中866條邊代表了蛋白之間的相互作用，按Degree值前30的靶蛋白見(jiàn)圖4，以白蛋白(ALB)、白介素6(IL-6)和絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)度值較高。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析 將紅花-黃芪與PBC的交集作用靶點(diǎn)，應(yīng)用R軟件的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler和pathview安裝包進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定對(duì)應(yīng)條目的

≤0.05，并繪制前20個(gè)基因的GO功能富集分析條形圖、KEGG通路富集分析條形圖和基因作用通路圖。

在灌水期間需要合理控制灌水量，促進(jìn)日常溫室中的番茄快速生根發(fā)芽。冬春期間番茄移苗、定植后和緩苗前要保水保墑，緩苗后，緩苗水為植株?duì)I造良好的生長(zhǎng)環(huán)境。秋冬季節(jié)，移苗和定植期間氣溫和地溫較高，需要結(jié)合植株生長(zhǎng)需要適當(dāng)增加澆水量，促進(jìn)緩苗。在生長(zhǎng)旺盛期間，適當(dāng)增加灌水次數(shù)和澆水量。合理控制澆水時(shí)間，以晴天為最佳，盡可能避免陰天澆水，中午高溫期間澆水可以有效提升地溫。灌水后棚室密封處理，溫度升高到30℃后通風(fēng)換氣，可以營(yíng)造良好的溫室生長(zhǎng)環(huán)境。

2.2 PBC靶點(diǎn)基因 從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)提取PBC靶點(diǎn)基因2 816個(gè)，從OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)提取PBC靶點(diǎn)基因280個(gè)，去重后共得到3189個(gè)疾病靶點(diǎn)。

1.1 對(duì)象 選擇2009年3月—2010年4月在上海市第八人民醫(yī)院臨床護(hù)理一線崗位、具有執(zhí)業(yè)資格的護(hù)士48名，均為女性。

2.6 紅花-黃芪治療PBC的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將紅花-黃芪與PBC的81個(gè)交集作用靶點(diǎn)應(yīng)用R軟件安裝包進(jìn)行紅花-黃芪治療PBC的GO功能富集分析(

<0.05)，繪制前20條GO條目，顏色越紅、圓點(diǎn)越大表示功能富集越密集，見(jiàn)圖5；同時(shí)，進(jìn)行KEGG通路富集分析(

<0.05)，繪制前20條KEGG信號(hào)通路，顏色越紅、條圖越長(zhǎng)表示此對(duì)應(yīng)信號(hào)通路的顯著性越高，此通路越重要，見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，共富集分析得到101條紅花-黃芪治療PBC的生物過(guò)程，根據(jù)基因比例，涉及的主要生物過(guò)程有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。共富集分析得到115條紅花-黃芪治療PBC的信號(hào)通路，主要涉及前列腺癌、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡和人類巨細(xì)胞病毒感染等信號(hào)通路。依據(jù)基因富集在通路中數(shù)目及

值，選擇卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號(hào)通路進(jìn)一步分析紅花-黃芪治療PBC的可能性。該通路圖主要影響白介素6、細(xì)胞間黏附分子1、凋亡信號(hào)分子(3、8、9)、核因子κB、核因子κB的抑制蛋白、IKK蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子1α、應(yīng)激激活蛋白激酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、糖原合成酶激酶3、細(xì)胞色素酶D1、AP-1及Cytc、Myc、Raf、RB的表達(dá)和β-連環(huán)蛋白，調(diào)控T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞所誘發(fā)的免疫反應(yīng)。

3 討論

PBC患者病理性質(zhì)總屬本虛標(biāo)實(shí)，氣虛則血行無(wú)以推動(dòng)則見(jiàn)血瘀，血瘀致氣機(jī)不暢則氣滯，氣滯血瘀日久化熱可暗耗陰血及腎精，精、血不足則生氣無(wú)源，故而氣虛更加明顯。再者，氣虛其運(yùn)化功能失調(diào)則見(jiàn)水濕內(nèi)停，濕滯郁熱，濕熱互結(jié)，致肝、膽、脾功能失調(diào)而發(fā)為黃疸；亦或外感濕熱，熏蒸肝膽、脾胃致其功能失調(diào)而發(fā)為黃疸。根據(jù)五行生克原理，肝脾病變終可累及于腎，從而耗傷腎精。 “氣”與“血”、“虛”與“瘀”在PBC的發(fā)生發(fā)展中相互作用、貫穿始終。

本研究得到紅花-黃芪與PBC交集靶基因81個(gè)，紅花、黃芪分別有14種和15種藥效成分協(xié)同作用于PBC的疾病靶點(diǎn)，以槲皮素、木犀草素和山萘酚較多，有效成分作用于PBC的前三靶點(diǎn)為PTGS1、PRSS1和AR。對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析顯示ALB、IL6、MAPK8自由度值較高，可能為紅花-黃芪治療PBC的核心蛋白。這些結(jié)果說(shuō)明紅花、黃芪可通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)來(lái)治療PBC。現(xiàn)有研究顯示，槲皮素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒等作用

，木犀草素具有抗炎、抗氧化、促凋亡、抗腫瘤、抗焦慮、神經(jīng)保護(hù)等作用

，山萘酚具有抗肝纖維化、降脂、抗氧化、抗炎保肝、促凋亡、抗腫瘤等作用

。結(jié)合本研究結(jié)果，紅花、黃芪的抗炎保肝、抗氧化及抗肝纖維化作用可能對(duì)PBC也具有一定療效。

進(jìn)一步進(jìn)行GO功能富集及KEGG通路富集分析顯示，紅花-黃芪治療PBC以DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性生物過(guò)程為主，主要通過(guò)前列腺癌、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號(hào)通路起作用。上述結(jié)果表明紅花-黃芪可能通過(guò)多種作用途徑對(duì)PBC起到治療作用。其中卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號(hào)通路P值較小、富集靶點(diǎn)數(shù)目最多，提示其在紅花-黃芪治療PBC中具有重要意義。此通路主要通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所誘導(dǎo)的相關(guān)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，抑制肝臟炎癥反應(yīng)及肝纖維化進(jìn)展，從而對(duì)PBC起到治療作用。PBC是一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全清楚。在PBC中，細(xì)胞凋亡在抗原提呈中起著重要作用，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(CASP)是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶。研究顯示，CASP3、CASP6、CASP8在PBC組織損傷中表達(dá)，尤其是CASP3高表達(dá)，其有可能產(chǎn)生免疫原性片段而有助于自身抗原和抗線粒體抗體產(chǎn)生，誘導(dǎo)疾病進(jìn)展

。有實(shí)驗(yàn)證明，次氯酸誘導(dǎo)的膽管上皮細(xì)胞凋亡可增加CASP3的活性及p-應(yīng)激激活蛋白激酶的表達(dá)，而谷胱甘肽的補(bǔ)充可減少膽管上皮細(xì)胞的凋亡，可成為治療PBC的選擇

。也有研究顯示肝細(xì)胞中CASP8缺失可以防止實(shí)驗(yàn)性膽汁淤積

。此外，CD40可通過(guò)Fas/Fas配體的介導(dǎo)來(lái)誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞凋亡，在激活的膽管上皮細(xì)胞內(nèi)核因子κB和AP-1均被激活；在缺乏核因子κB情況下，AP-1的激活可能是決定CD40參與誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素

。有研究顯示，抑制核因子κB可減輕促炎因子釋放從而改善肝細(xì)胞凋亡和組織損傷，這可能緩解PBC疾病進(jìn)展

。因此，針對(duì)核因子κB和AP-1的靶點(diǎn)也值得進(jìn)一步研究。也有研究顯示，白介素1、白介素6、白介素9、白介素10和白介素17在PBC中高表達(dá)，在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮促炎、促纖維化作用，可作為治療PBC的靶點(diǎn)

。在PBC中，細(xì)胞間黏附分子1可能通過(guò)與其配體-淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1結(jié)合誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞外滲和淋細(xì)胞介導(dǎo)的膽管破壞，其膽管的破壞不僅發(fā)生在膽管中，也發(fā)生在Hering管中

。有研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在PBC中表達(dá)較顯著，其表達(dá)與肝祖細(xì)胞數(shù)量、膽管反應(yīng)的延長(zhǎng)和血管生成相關(guān)，在其纖維化過(guò)程和癌變的管理中意義重大

，值得引起重視。在PBC中，β-連環(huán)蛋白和Myc表達(dá)活性與Wnt通路有關(guān)，也可作為治療PBC的潛在靶點(diǎn)進(jìn)一步研究

。該通路涉及的缺氧誘導(dǎo)因子1α、Raf、RB、Cytc、細(xì)胞色素酶D1、糖原合成酶激酶3目前尚無(wú)其關(guān)于PBC的研究，可作為PBC的潛在研究靶點(diǎn)。

貴州省自然環(huán)境優(yōu)美，交通便利，民族文化豐富多彩、特色鮮明，歷史文化底蘊(yùn)豐厚，因此，該區(qū)域的民族文化遺產(chǎn)作為旅游資源具有極大的開(kāi)發(fā)利用優(yōu)勢(shì)。

綜合分析，紅花-黃芪可能以槲皮素、木犀草素和山萘酚等主要活性成分通過(guò)前列腺癌、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號(hào)通路作用于PTGS1、PRSS1、AR、ALB、IL6和MAPK8等靶點(diǎn)來(lái)治療PBC。本研究是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的數(shù)據(jù)挖掘分析，研究中未探討紅花、黃芪的藥物劑量及藥物有效成分之間相互作用對(duì)PBC治療的影響，其研究結(jié)果有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究來(lái)證實(shí)。

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