丹梔逍遙散對非酒精性脂肪性肝病大鼠LKB1/AMPK/ACC通路及肝脂肪變性的影響*

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指無過量飲酒史，脂肪過度積累于肝細胞內，導致肝臟脂肪變性的一種慢性脂肪儲積綜合征，是肥胖患者常見的肝病之一

，可由非酒精性單純性脂肪肝進展為肝炎、肝纖維化、肝硬化、甚至肝癌

。隨著人們生活水平的不斷提高，其發(fā)病率逐年增加，并呈年輕化趨勢，嚴重威脅人們的健康和生命

。目前尚無治療NAFLD的特效藥，現代醫(yī)學多以降糖減脂為主

。因此，尋找安全有效治療NAFLD的藥物是臨床亟待解決的問題。近年來中藥在減重降脂、改善脂肪肝方面有顯著優(yōu)勢，如藿樸夏苓湯可降低高脂飲食誘導的NAFLD小鼠血脂水平，改善肝功能，減少肝臟脂質累積

；健脾疏肝降脂方可通過調節(jié)機體脂肪代謝，治療NAFLD效果顯著

。丹梔逍遙散具有疏肝健脾、清熱活血的功效，符合中醫(yī)學對NAFLD以疏肝健脾為主的治療原則。LKB1/AMPK/ACC通路在肥胖癥中研究較多，是脂代謝的關鍵通路，而肥胖與NAFLD關系密切，約90%的肥胖患者伴有NAFLD，其嚴重程度與肥胖程度呈正比

。基于此，本研究通過高脂膳食復制NAFLD大鼠模型，探究丹梔逍遙散對非酒精性脂肪肝大鼠LKB1/AMPK/ACC通路及肝脂肪變性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠78只，SPF級，體質量(120±20)g，由北京維通利華動物中心提供，許可證號為SCXK(京)2016-0011，所有動物均嚴格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為24℃，濕度為50%，12 h明暗交替，自由飲水和攝食。飼養(yǎng)3 d后開始實驗。高脂飼料(81.5%基礎飼料、3%膽固醇、0.5%三號膽鹽、5%蛋黃粉、10%豬油)購自北京博愛港商貿有限公司。

風險導向審計在對審計對象進行風險評估時，不僅要求對審計對象進行內控檢查，而且還要求對其管理層的誠信保持職業(yè)警覺，這就要求審計人員充分擴展審計范圍。

1.2 藥品及試劑 丹梔逍遙散(白術、當歸、山梔子、芍藥各10 g，柴胡6 g，茯苓、牡丹皮各15 g，薄荷、煨姜、甘草各5 g)購自河南張仲景大藥房。上述藥材加入8倍量的水充分浸泡30 min，煎煮40 min，過濾藥液，藥渣再加入6倍量的水繼續(xù)煎煮40 min后過濾藥液，合并兩次藥液，煎煮濃縮至100 ml。1 ml相當于生藥0.91 g。水飛薊賓膠囊(批號：950701001)。天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、總膽固醇( TC)、三酰甘油(TG)、游離脂肪酸( NEFA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為C0010-2、C009-2、A111-2、A110-2、A042-2)。HE染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒(批號分別為C0105、P0013B、P0012S)。兔抗p-AMPKα1(bs-5551R)、兔抗AMPKα1(bs-10344R)、兔抗p-AMPKα2(Thr172)(bs-4002R)、兔抗AMPKα2(bs-2771R)、兔抗p-LKB1(bs-3249R)、兔抗LKB1(bs-3948R)、兔抗p-ACC(bs-3039R)、兔抗ACC(bs-11912R)、兔抗GAPDH(bs-0755R)、羊抗兔IgG(H+L)/HRP(bs-40295G)，購自北京博奧森生物科技有限公司。多功能酶標儀(Bio-Rad公司)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 動物分組及給藥 將78只大鼠隨機分為6組：空白組、模型組、水飛薊賓組

(26.25 mg·kg

)、丹梔逍遙散高、中、低劑量組

，每組13只?？瞻捉M大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組大鼠用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)8周復制NAFLD模型

，8周后各組隨機抽取1只大鼠處死，HE染色觀察肝組織變化，確認造模成功。第9周開始給藥，給藥組大鼠灌胃相應的藥物，空白組和模型組大鼠灌胃等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥4周。給藥劑量按成人平均體質量60 kg體表面積換算，則大鼠每日給藥劑量為9.5 g·kg

，因此設置低、中、高劑量藥物劑量為9.5、19.0、38.0 g·kg

。實驗過程中大鼠均未死亡。

2.4 各組大鼠肝組織病理檢測結果 見圖1。

但不得不提一點中華門最大的遺憾。中華門位于秦淮河風景帶，前有報恩寺后有夫子廟老門東，可見其地位優(yōu)勢明顯，但我們在考察過程中沒有發(fā)現中華門城堡對其周圍旅游資源的充分利用。報恩寺臨近的秦淮河完全可以作為連接中華門城堡和報恩寺的紐帶，秦淮河上也有游船以供使用，但是兩方還未達成合作，相近的文化淵源、相近的地理位置都沒能協(xié)調開發(fā)，這樣的資源白白浪費實為可惜。如果能讓游客持一張門票出游兩個或多個景點，那游客的旅游熱情以及周邊一系列的旅游資源潛力都將會被充分挖掘，這對中華門城堡來說未嘗不是一件好事。

2.3 各組大鼠體重變化情況 見表2。

2.2 各組大鼠臟器指數檢測情況 見表1。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 空白組大鼠毛色光滑有光澤，精神狀態(tài)較好，較活躍，飲食正常，體重緩慢增加；模型組大鼠毛色發(fā)黃暗淡，精神萎靡，不活躍，嗜睡，個體較大，體重增加較快；水飛薊賓組和丹梔逍遙散各劑量組大鼠毛色較整潔光滑，精神較為充沛，活動有所增加，體重緩慢增加，大鼠一般狀態(tài)有不同程度的改善，且丹梔逍遙散高劑量組大鼠一般狀態(tài)的改善效果和水飛薊賓組相似，更接近于空白組。

他還倡導青年走與工農相結合的成長道路，廣大青年應當投身于工農運動之中，堅持理論與實踐的統(tǒng)一；我國的農村也需要廣大青年的建設，要改變落后的農村狀況，需要青年知識分子的知識與技術引領。他說：“青年常在都市中混的，都成了鬼蜮；農村中絕不見知識階級的足跡，也就成了地獄?！盵2]650而且，李大釗還高度重視培養(yǎng)青年的健全人格，認為青年要在社會變革中發(fā)揮出自己的積極作用，必須樹立起正確的人生價值觀來指引自己的未來發(fā)展道路。

1.4 觀察指標 ①形態(tài)學觀察：給藥期間，觀察各組大鼠的精神狀況、毛色、飲食、活動等一般狀態(tài)并記錄。②體重變化：稱取給藥前后大鼠體重，計算大鼠體重增加量(每次稱量體重前禁食12 h，不禁水)。③大鼠臟器指數：大鼠處死后，迅速在冰上剝離肝臟、腎臟、脾臟，用預冷的生理鹽水洗去殘留血跡，濾紙吸掉表面水分，稱取相應臟器的濕重，計算臟器指數。臟器指數=臟器濕重(g)/大鼠體重×100%。④肝組織中ALT、AST、TG、TC、NEFA含量測定：稱取適量大鼠肝組織，檢測肝勻漿中ALT、AST、TG、TC、NEFA含量。⑤肝組織病理學改變：每只大鼠于肝臟左葉相同位置切取一小塊組織制作切片。光學顯微鏡下觀察肝臟病理學變化。⑥Western blot檢測肝組織中LKB1、AMPKα1、AMPKα2、ACC及其磷酸化水平表達：檢測肝組織中LKB1、AMPKα1、AMPKα2、ACC及其磷酸化的表達水平。

2.5 各組大鼠肝組織LKB1、AMPKα1、AMPKα2、ACC及其磷酸化水平檢測情況 見圖2、表3。

考慮到極端情況，譬如因為主監(jiān)控中心火災或者受非典疫情等影響，造成主監(jiān)控中心不能再繼續(xù)辦公，這時要求備用監(jiān)控中心應選在遠離原中心的另一幢大樓里，考慮到交通便利和辦公設施方便等原因，故選址定在離原監(jiān)控中心大約 10公里的220kV**變電站內，該處也在城區(qū)范圍內，交通和通信便利，便于開展各項工作。

2.6 各組大鼠肝組織中ALT、AST、TG、TC、NEFA檢測結果 見表4。

3 討論

NAFLD以肝細胞中脂肪變性和蓄積為主要特征，其發(fā)病機制尚未完全明確，多認為與血脂紊亂有關。目前臨床上尚無治療該病的特效藥，現代醫(yī)學多采用降脂降糖治療

。中醫(yī)學認為NAFLD的發(fā)病機制與脾虛、肝郁氣滯、血瘀等有關，對NAFLD的證型研究發(fā)現，肝郁脾虛在NAFLD的病機中最為常見，治療的關鍵在于疏肝健脾、活血化瘀

。宋紅磊

采用疏肝健脾化濁湯治療NAFLD患者，發(fā)現其可有效改善患者的肝功能，降低血脂水平；林智平等

用疏肝健脾法聯(lián)合中藥外敷治療肝郁脾虛型NAFLD效果確切。丹梔逍遙散具有清熱利濕、活血化瘀、疏肝健脾的功效，臨床上廣泛應用于各科疾病，臨床研究發(fā)現丹梔逍遙散可明顯降低NAFLD患者肝功能相關指標和血脂相關指標水平，改善患者的肝功能

。本研究結果顯示，丹梔逍遙散可明顯改善NAFLD模型大鼠的肝功能，對NAFLD大鼠具有防護作用。

Noureddin等

提出脂肪合成通路的激活是影響NAFLD患者病情進展的主要原因。LKB1/AMPK/ACC通路是脂肪合成和代謝的關鍵通路。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是促進脂肪酸合成的限速酶，活化后可以促進長鏈脂肪酸的合成并阻止其分解。ACC的活性受去磷酸化和磷酸化的調節(jié)，去磷酸化后激活，磷酸化后則失去活性。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是脂代謝的關鍵激酶，活化的AMPK可以使ACC磷酸化，抑制ACC的活性，抑制脂肪、TG、TC的合成

。肝臟激酶B1(LKB1)是AMPK上游激酶，可以在多種細胞內使AMPKα亞單位上的蘇氨酸172位磷酸化，從而激活AMPK進而調節(jié)機體的代謝以及細胞增殖等

。孟勝喜等

研究發(fā)現激活LKB1/AMPK/ACC信號通路可能是祛濕化瘀方防治NAFLD的重要作用機制之一。本研究結果顯示，NAFLD大鼠LKB1-AMPK-ACC信號通路蛋白表達受到影響，脂肪合成增加。丹梔逍遙散干預后，大鼠肝臟p-LKB1/LKB1、p-AMPKα1/AMPKα1、p-AMPKα2/AMPKα2、p-ACC蛋白表達水平明顯升高，ACC蛋白表達、TG、TC、NEFA水平顯著降低，提示丹梔逍遙散可能通過LKB1/AMPK/ACC信號通路，降低脂肪的合成，改善肝功能，減輕NAFLD大鼠肝脂肪變性，且呈一定的劑量依賴性。

綜上所述，丹梔逍遙散可改善高脂膳食誘導的NAFLD大鼠的肝功能和肝脂肪變性，對NAFLD具有防護作用，其作用機制可能與LKB1/AMPK/ACC信號通路有關。但是由于條件限制，本研究只在動物水平進行了驗證，下一步可從細胞水平上進行深入探討。此外，丹梔逍遙散能否通過其他途徑，減輕NAFLD大鼠肝脂肪變性，有待后續(xù)深入研究。

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