高膽紅素血癥新生兒血清miR-122水平與肝功能各項(xiàng)指標(biāo)及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏的相關(guān)性研究*

膽紅素主要來源于血紅蛋白，大量蓄積可引起一定的細(xì)胞和組織毒性

。由于新生兒膽紅素生成率遠(yuǎn)高于成人，而肝臟代謝率和清除率卻較低，因此，易造成新生兒高膽紅素血癥(NHB)

。NHB的主要嚴(yán)重后果包括肝腎損傷、腦損傷等

。雖然絕大多數(shù)新生兒的NHB可以自愈或經(jīng)治療后痊愈，但仍然需要及時(shí)和準(zhǔn)確地檢測新生兒各項(xiàng)肝腎功能，以免引起靶器官不可逆的損傷。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)缺乏與NHB也密切相關(guān)。而miR-122屬于肝組織表達(dá)特異性miRNA，可全程參與肝細(xì)胞分化、肝組織發(fā)育以及維持肝代謝穩(wěn)態(tài)等。本研究通過檢測足月新生兒血清miR-122相對表達(dá)量，分析其與肝功能各項(xiàng)指標(biāo)及G-6-PD的關(guān)系，為尋找預(yù)測肝損傷的早期敏感指標(biāo)、為NHB新生兒的個(gè)體化治療提供新的理論依據(jù)。

數(shù)據(jù)錄入需要采用本地?cái)?shù)據(jù)和遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)結(jié)合錄入方式進(jìn)行。具有錄入權(quán)限的工作人員可在任何時(shí)間地點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入。如果錄入格式出現(xiàn)錯(cuò)誤，可調(diào)用WEbService軟件出發(fā)數(shù)據(jù)庫存儲(chǔ)過程，對于相關(guān)數(shù)據(jù)直接對應(yīng)數(shù)據(jù)庫列表進(jìn)行文件域名修改。采用上述數(shù)據(jù)采集和錄入方式可節(jié)省大量數(shù)據(jù)錄入工作量，不僅提高數(shù)據(jù)采集入庫速度，更具有高強(qiáng)容錯(cuò)率，有效降低數(shù)據(jù)采集成本［4］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 調(diào)取2020年3月至2020年5月我院足月分娩的217例新生兒病案資料，男126例，女91例，日齡2～7 d。根據(jù)TBil的臨床檢測結(jié)果將217例新生兒分為NHB組144例，非NHB組73例。兩組新生兒的性別構(gòu)成、胎齡、日齡、出生平均體重、身長、分娩方式、新生兒Apgar評分、體溫、心率、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓以及產(chǎn)婦的基本特征等基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

>0.05)，具有可比性，見表1。

從圖6可以看出，衛(wèi)星轉(zhuǎn)發(fā)器本振的輸出頻率值相對于標(biāo)稱頻率值有100 Hz的固定偏差，并且存在幅值100 Hz左右的類正弦變化趨勢。對于頻率的慢漂移趨勢，我們認(rèn)為主要是由于衛(wèi)星所處空間環(huán)境變化引起的。圖7表示上行導(dǎo)航信號經(jīng)過衛(wèi)星轉(zhuǎn)發(fā)器頻率變化后播發(fā)給用戶的信號載波頻率值，根據(jù)誤差計(jì)算公式，由式（8）可以估算單頻計(jì)算方法得到的衛(wèi)星本振輸出頻率的相對準(zhǔn)確度為

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①足月(胎齡37～42周)順產(chǎn)式剖宮產(chǎn)新生兒；②完成血紅蛋白電泳及G-6-PD篩查；由我院檢驗(yàn)科提供完整的檢測結(jié)果；③Apgar評分≥7分；④診斷符合《實(shí)用新生兒學(xué)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)

，若新生兒皮膚出現(xiàn)中、重度黃染，且血清TBil>220.6 μmol /L則診斷為NHB。排除標(biāo)準(zhǔn)：①RH溶血病、先天性發(fā)育異常、染色體疾病、膽道閉鎖、感染者；②嚴(yán)重心、肝、腎、肺功能發(fā)育不全者。

1.1.3 儀器:日立7020型全自動(dòng)生化分析儀;Beckman-Coulter MAXM血球分析儀;電子稱(常熟市雙杰測試儀器廠產(chǎn)品);萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品);Thermo BIOFUGE PRIMO R型離心機(jī)。

2.1 兩組新生兒血清miR-122檢測結(jié)果 經(jīng)QPCR法檢測，NHB組和非NHB組新生兒血清miR-122相對表達(dá)量分別為(1.00±0.18)和(1.47±0.84)，兩者比較NHB組新生兒血清miR-122相對表達(dá)量升高，經(jīng)獨(dú)立樣本

檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

=4.721，

<0.001)。

1.5 亞組分組方法 根據(jù)G-6-PD<1.0即確診為G-6-PD缺乏癥。根據(jù)血清TBil濃度，分為3個(gè)亞組即輕度亞組(TBil：220.6～256.5 μmol /L)、中度亞組(TBil：256.6～342.0 μmol /L)、重度亞組(TBil：>342.0 μmol /L)。

1.4 各指標(biāo)檢測方法 ①使用BC-5380儀(深圳邁瑞醫(yī)療公司)行血常規(guī)檢測，試劑盒均為儀器原配；使用AL15800儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測肝功能各項(xiàng)指標(biāo)和紅細(xì)胞G-6-PD；采用SeblA-Minicap毛細(xì)管電泳儀(法國SEBIA公司)檢測HGB，試劑盒購自法國SEBIA公司。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測血清miR-122水平，用mirVana PARIS試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

3.1 NHB對肝功能各項(xiàng)指標(biāo)的影響 NHB是新生兒中最常見的臨床癥狀之一，分為病理性NHB和生理性NHB。本研究217例足月新生兒中，NHB的發(fā)病率約為66.36%(144/217)，與多數(shù)國內(nèi)研究得到的發(fā)病率基本一致。我們納入的NHB患兒大多是在出生24 h后出現(xiàn)皮膚和鞏膜黃染，同時(shí)伴有血清TBil水平迅速升高，出生2～3 d時(shí)TBil水平達(dá)到峰值，多數(shù)患兒隨著TBil的代謝和排泄病情會(huì)逐漸減輕直至消失，但也有部分患兒血清TBil水平持續(xù)性升高，進(jìn)而可能會(huì)導(dǎo)致肝功能損傷。在新生兒中，膽紅素主要是由紅細(xì)胞分解產(chǎn)生的，首先釋放出Hb，Hb在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)經(jīng)歷兩個(gè)階段的分解代謝后進(jìn)一步產(chǎn)生膽紅素。這種未結(jié)合的(間接的)膽紅素通過與血清白蛋白結(jié)合在循環(huán)血中被轉(zhuǎn)運(yùn)。而在肝臟中則與肝內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖醛酸結(jié)合，產(chǎn)生水溶性膽紅素單或雙葡萄糖醛酸，即結(jié)合膽紅素(或直接膽紅素)。結(jié)合膽紅素是膽汁的一種重要組成成分，通過膽道系統(tǒng)進(jìn)入腸道。雖然結(jié)合膽紅素的一部分可被β-葡萄糖醛酸酶水解成小腸中的未結(jié)合膽紅素，在那里它被重新吸收(肝腸循環(huán))，但大多數(shù)是隨著糞便排出的。因此若未結(jié)合膽紅素在循環(huán)血和肝臟中大量蓄積，可增加肝腸循環(huán)負(fù)擔(dān)，進(jìn)而影響肝功能指標(biāo)。

2 結(jié)果

對不同種源/家系樟樹株高和地徑進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明不同種源、家系樟樹株高(F=12.747，F(xiàn)0.01=2.95；F=3.584，F(xiàn)0.01=1.75)和地徑(F=8.231，F(xiàn)0.01=2.95；F=3.998，F(xiàn)0.01=1.75)生長均差異極顯著，表明不同種源對樟樹1a生扦插苗株高和地徑生長產(chǎn)生顯著影響，且種源內(nèi)各家系1 a生扦插苗株高和地徑也存在顯著差異。

2.4 NHB組新生兒血清miR-122相對表達(dá)量與G-6-PD缺乏的關(guān)系 經(jīng)TargetScan和miRanda在線數(shù)據(jù)庫檢索，miR-122存在與G-6-PD mRNA互補(bǔ)的保守序列。經(jīng)活性檢測，22例新生兒G-6-PD缺乏，G-6-PD缺乏患兒血清miR-122相對表達(dá)量顯著高于G-6-PD活性正常新生兒[3.31(2.28，3.71)對1.10(0.90，1.35)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

=36.831，

<0.001)。見圖1。

2.3 3個(gè)亞組新生兒肝功能各項(xiàng)指標(biāo)、血清miR-122、G-6-PD結(jié)果比較 見表3。 與輕度亞組和中度亞組比較，重度亞組NHB新生兒血清ALT、AST、GGT、TBil、CRP、PCT水平以及血清miR-122相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

<0.05)。隨著新生兒NHB疾病嚴(yán)重程度加重，G-6-PD缺乏癥患兒的比例也逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

<0.05)。

1.3 研究方法 比較兩組新生兒血常規(guī)、肝功能指標(biāo)(包括ALT、AST、GGT、ALP、Alb、TBil)等檢測結(jié)果及miR-122、紅細(xì)胞G-6-PD活性，探討兩組新生兒血清miR-122水平與肝功能各項(xiàng)指標(biāo)及G-6-PD的關(guān)系。

2.2 兩組新生兒血常規(guī)和肝功能結(jié)果 見表2。

2.5 NHB組新生兒血清miR-122相對表達(dá)量與肝功能各項(xiàng)指標(biāo)的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，NHB患兒血清miR-122相對表達(dá)量與ALT、AST、GGT、TBil、PCT水平呈正相關(guān)性，

=0.173，0.425，0.524，0.550，0.272，

<0.05；但是與ALP、Alb、HGB、CRP水平無顯著相關(guān)性(

>0.05)。見圖2。

3 討論

Siu等

對1 164名NHB新生兒的臨床檢查數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)8.4%(98/1164)的NHB新生兒出現(xiàn)ALT異常升高，5.07%(59/1164)NHB新生兒出現(xiàn)ALP異常升高。而且國內(nèi)眾多研究也證實(shí)，NHB新生兒普遍存在某項(xiàng)或多項(xiàng)肝功能指標(biāo)異常情況。拜福蘭等

通過對比120例NHB新生兒和40例健康新生兒的肝功能結(jié)果，發(fā)現(xiàn)NHB新生兒GGT、ALP、AST、LDH、TBA水平均明顯升高，可用于該疾病引起的肝功能及心肌損傷檢測。梁健偉等

通過對清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科住院的2325例NHB新生兒臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)NHB能夠造成心肌損傷，對肝功能指標(biāo)(包括AST、ALT、GGT、血清總蛋白、Alb等)也有一定影響。ALT、GGT、Alb、ALP等都是反映肝臟代謝功能的重要指標(biāo)，但并非肝組織損傷的特異性指標(biāo)。而AST主要存在于肝臟，因此相較于其他肝功能指標(biāo)，AST對肝細(xì)胞損傷診斷的特異性更高。本研究結(jié)果一方面說明NHB患兒肝臟代謝速度加快，另一方面也說明檢測肝功能指標(biāo)可用于NHB的診斷和篩查，但并不能完全支持肝功能損傷的病理現(xiàn)象。

3.2 miR-122與NHB新生兒肝功能各項(xiàng)指標(biāo)的關(guān)系 miR-122是一種普遍存在于真核生物中的肝臟特異性miRNA。成熟miR-122具有完整保守的基因序列，通過調(diào)節(jié)多種靶mRNAs的表達(dá)參與肝功能和肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。有研究顯示，通過藥理學(xué)和遺傳學(xué)手段影響肝細(xì)胞miR-122表達(dá)，可導(dǎo)致機(jī)體和肝臟脂質(zhì)代謝失調(diào)、鐵穩(wěn)態(tài)失衡以及肝細(xì)胞分化紊亂

。Thakral等

還證實(shí)，在動(dòng)物肝損傷模型早期，肝細(xì)胞會(huì)特異性表達(dá)和釋放大量miR-122進(jìn)入體液，而且循環(huán)血中miR-122水平升高早于AST、ALP等指標(biāo)，因此在眾多肝損傷疾病中miR-122被認(rèn)為是最具潛力的肝損傷生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果提示NHB可能會(huì)導(dǎo)致肝功能損傷，而且隨著NHB加重，對肝功能的損傷影響更明顯。Sharapova等

認(rèn)為miR-122作為組織病理學(xué)或血清學(xué)生物標(biāo)志物對肝損傷的診斷效能優(yōu)于ALT，其表現(xiàn)與AST相當(dāng)。將miR-122納入常規(guī)肝功能檢測，可提高對肝損傷預(yù)測的準(zhǔn)確率。因此臨床上除了密切監(jiān)視新生兒AST、ALT、GGT、ALP、Alb等常規(guī)肝功能指標(biāo)的變化外，可考慮增加miR-122檢測，作為評估肝功能損傷的參考指標(biāo)。

有些老師對課程空間建設(shè)沒有經(jīng)驗(yàn)，上傳了大量資料，讓課程教學(xué)空間結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，導(dǎo)致需要學(xué)習(xí)觀看的內(nèi)容很難找到，反而不利于學(xué)生學(xué)習(xí)，因此，課程教學(xué)空間建設(shè)亟待出臺建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)針對學(xué)生使用而制訂，一切以方便學(xué)生學(xué)和老師教為標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 miR-122與NHB新生兒G-6-PD缺乏的關(guān)系 G-6-PD是戊糖磷酸途徑中參與第一步反應(yīng)的限速酶，其目的在于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，從而提高細(xì)胞的抗氧化能力。而紅細(xì)胞中NADPH的唯一來源是戊糖磷酸途徑，因此G-6-PD在紅細(xì)胞中的氧化損傷防御中發(fā)揮著重要的作用。G-6-PD缺乏癥是一種典型的由G-6-PD基因突變引起的X連鎖遺傳缺陷，是引起新生兒NHB的重要因素之一。本研究中NHB組新生兒G-6-PD缺乏的發(fā)生率約為10.14%(22/217)，且在重度NHB患兒中G-6-PD缺乏的發(fā)生率相對更高。許多研究表明，G-6-PD缺乏癥患兒的膽紅素水平明顯高于G-6-PD正常兒

。因此G-6-PD水平與新生兒NHB的發(fā)生也有一定的關(guān)聯(lián)。G-6-PD缺乏癥除了與G-6-PD基因突變有關(guān)外，與G-6-PD表達(dá)缺失導(dǎo)致酶活性降低或喪失也有一定關(guān)聯(lián)。Ben Fredj等

也證實(shí)G-6-PD酶活性降低或表達(dá)缺失可導(dǎo)致新生兒肝功能損傷以及嚴(yán)重的新生兒膽汁淤積癥。本研究結(jié)果提示miR-122可通過影響G-6-PD活性降低或缺失進(jìn)而影響肝功能，也從側(cè)面證實(shí)檢測新生兒血清miR-122相對表達(dá)量有助于更準(zhǔn)確地評估NHB新生兒疾病嚴(yán)重程度以及肝功能情況。

綜上所述，在NHB新生兒中，血清miR-122相對表達(dá)量普遍升高，并且與AST、ALT、GGT、TBil、PCT水平呈正相關(guān)性，與G-6-PD酶活性缺乏密切相關(guān)，因此增加血清miR-122水平檢測有助于更準(zhǔn)確地評估NHB患兒肝損傷情況，從而為臨床針對性治療提供一定的指導(dǎo)。

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