大麻素受體2激動劑在谷氨酸氧化應(yīng)激損傷中保護(hù)作用實驗研究

張霞婧，井紫薇，朱芳蕓，小 輝，邵勇平，鄭 凌

(1.西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710038)

隨著許多大麻成分(大麻素)的鑒定和內(nèi)源性大麻素信號系統(tǒng)的闡明，人們逐漸認(rèn)識到內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病中起著重要的生理和病理作用[1]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)由大麻素受體1和2(CB1和CB2)、內(nèi)源性大麻素Δ9-四氫大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)以及內(nèi)源性大麻素合成代謝酶和分解代謝酶組成。內(nèi)源性大麻素信號參與調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官和生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、大腦發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸可塑性，具有調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子的作用，與多種中樞神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。

內(nèi)源性大麻素主要通過其受體CB1和 CB2發(fā)揮作用，CB1又稱中樞型大麻素受體，CB2又稱外周型大麻素受體[3]。由于CB2在免疫細(xì)胞和組織上的高度表達(dá)，CB2受體一直被作為治療性免疫調(diào)節(jié)或抗炎靶標(biāo)的潛力研究的焦點。已有研究表明，當(dāng)CB2被激活時可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥表型轉(zhuǎn)化，抑制炎癥因子的生成。在阿茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)、多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis，MS)和肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophic laternal sclerosis，ALS)等疾病的小膠質(zhì)細(xì)胞中選擇性地高表達(dá)CB2[4]。小膠質(zhì)細(xì)胞也是大腦中的固有免疫細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要發(fā)揮免疫監(jiān)視和類似組織中巨噬細(xì)胞的作用[5]。目前研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞具有“雙刃劍”效應(yīng)，即可發(fā)揮細(xì)胞毒作用釋放炎性介質(zhì)和趨化因子，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，造成組織損傷，又可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，限制炎癥進(jìn)展，對于維持組織穩(wěn)態(tài)和應(yīng)對感染和損傷具有重要意義[6-7]。

據(jù)文獻(xiàn)報道，谷氨酸能神經(jīng)傳遞負(fù)責(zé)許多認(rèn)知、運動、感覺和自主神經(jīng)活動[8]，在大腦代謝過程中具有重要作用。谷氨酸受體是大腦中最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，負(fù)責(zé)調(diào)控神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中絕大多數(shù)的興奮性信號傳遞[9]。但在帕金森、癲癇、腦缺血再灌注損傷等病理狀態(tài)下或暴露于一些有毒物質(zhì)時，谷氨酸被大量釋放到細(xì)胞外堆積于突觸間隙，使谷氨酸受體過度激活，產(chǎn)生興奮性毒性，造成神經(jīng)元損傷[10-11]。研究表明，大量釋放的谷氨酸可通過氧化和硝基化產(chǎn)生大量氮氧自由基和過氧化產(chǎn)物，而腦內(nèi)抗氧化酶含量較低，容易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)元變性[12]，并且谷氨酸受體被過度激活誘發(fā)的Ca2+超載還會引發(fā)細(xì)胞凋亡，加重神經(jīng)功能異常[13]。在離體研究中，CB2受體激活可減輕谷氨酸誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞損傷[14]，但其對神經(jīng)元的作用尚不清楚。本研究擬評價CB2受體激活對谷氨酸誘發(fā)共培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的損傷中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 采用Transwell小室(底部為0.4 μm微孔聚碳酸酯膜)，建立 N9 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系(中科院上海生命科學(xué)研究所惠贈)和 HT22 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科惠贈)共培養(yǎng)體系，N9小膠質(zhì)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板下層， HT22神經(jīng)元接種于Transwell小室中，密度均為106個/孔，用含10%胎牛血清、50 μmol/L的β-巰基乙醇、100 U/ml的青霉素、100 U/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境為5% CO2和95% O2，溫度為37 ℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將共培養(yǎng)細(xì)胞分為四組(n=26)：對照組(Con組)、谷氨酸組(Glu組)、CB2受體激動劑AM1241+谷氨酸組(AM1241+Glu組)和AM1241+CB2受體激動劑AM630+谷氨酸組(AM1241+AM630+Glu組)。Con組正常培養(yǎng)24 h；Glu組用含10 mmol/L谷氨酸(西安科昊試劑公司)的培養(yǎng)基孵育24 h；AM1241+Glu組用含2 μmol/L AM1241(Alexis 公司，瑞士)和10 mmol/L谷氨酸的培養(yǎng)基孵育24 h；AM1241+AM630+Glu組含2 μmol/L AM1241、6 μmol/L AM630(Alexis 公司，瑞士)及10 mmol/L谷氨酸的培養(yǎng)基孵育24 h。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力：將Transwell小室轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板中，棄去N9小膠質(zhì)細(xì)胞和HT22神經(jīng)元培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，加入5 mg/ml MTT(Sigma 公司，美國)溶液100 μl，37 ℃孵育4 h；小心吸出培養(yǎng)液，每孔加750 μl 二甲基亞砜，震蕩10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解并混勻后，各組均吸取150 μl 溶液加入96孔培養(yǎng)板中，于490 nm波長處，用酶聯(lián)免疫檢測儀(Tecan 公司，奧地利)測定吸光度值，反映細(xì)胞活力。

1.2.3 LDH、SOD及MDA 檢測：吸取各組培養(yǎng)基上清液，室溫1000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min，采用化學(xué)比色法測定乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性及 丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量，用胰蛋白酶溶液消化收集HT22細(xì)胞檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的活性，嚴(yán)格按照各指標(biāo)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 四組N9小膠質(zhì)細(xì)胞和HT22神經(jīng)元細(xì)胞活力比較 與Con組比較，Glu組、AM1241+Glu組和AM1241+AM630+Glu組細(xì)胞活力降低(均P<0.05)；與Glu組比較，AM1241+Glu組細(xì)胞活力升高(P<0.05)；與AM1241+Glu組比較，AM1241+AM630+Glu組細(xì)胞活力降低(P<0.05)，見表1。

表1 四組N9小膠質(zhì)細(xì)胞和HT22神經(jīng)元細(xì)胞活力比較(%)

2.2 四組LDH、SOD活性及MDA含量比較 與Con組比較，Glu組、AM1241+Glu組LDH活性和MDA含量升高，SOD活性降低(均P<0.05)，AM1241+AM630+Glu組LDH活性升高，SOD活性降低(均P<0.05)；與Glu組比較，AM1241+Glu組LDH和MDA含量降低，SOD活性升高(均P<0.05)；與AM1241+Glu組比較，AM1241+AM630+Glu組LDH和MDA含量升高，SOD活性降低(均P<0.05)，見表2。

表2 四組LDH、SOD活性及MDA含量比較

3 討 論

本研究參照文獻(xiàn)[14]選擇谷氨酸的濃度為10 mmol/L，結(jié)果表明，與Con組比較，Glu組N9小膠質(zhì)細(xì)胞和HT22神經(jīng)元活力降低，培養(yǎng)基中LDH漏出量升高，提示谷氨酸模型制備成功。

AM1241為CB2受體特異性激動劑，AM630為CB2受體特異性拮抗劑，本研究參照文獻(xiàn)[14]選擇AM1241濃度為2 μmol/L，AM630濃度為6 μmol/L，結(jié)果表明，與Glu組比較，AM1241+Glu組細(xì)胞活力升高，LDH活性降低，而與AM1241+Glu組比較，AM1241+AM630+Glu組細(xì)胞活力降低，LDH活性升高(均P<0.05)，提示CB2受體激活可減輕谷氨酸誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞和HT22神經(jīng)元損傷。

CB2受體在腦內(nèi)主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞[1]。本研究采用Trans well小室建立小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，觀察CB2受體激活對谷氨酸損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，排除其他類型膠質(zhì)細(xì)胞的影響研究小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的相互作用，更接近生理狀態(tài)。神經(jīng)元介導(dǎo)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)傳遞及感覺運動等主要功能，膠質(zhì)細(xì)胞主要起支持營養(yǎng)和輔助作用[15]，神經(jīng)元和各種膠質(zhì)細(xì)胞存在復(fù)雜的相互作用，是不可分割的整體[16]。小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的相互作用有助于大腦穩(wěn)態(tài)。神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)系的改變會導(dǎo)致腦部疾病狀態(tài)，包括對突觸功能的改變以及神經(jīng)元存活的影響[17]。

有研究表明，谷氨酸介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、興奮性毒性和神經(jīng)毒癥是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中常見的潛在事件。氧化應(yīng)激學(xué)說在神經(jīng)毒性機(jī)制研究中占有重要地位，氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物介導(dǎo)組織損傷，氧化應(yīng)激及自由基的大量生成被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個重要因素。興奮性毒性是興奮性氨基酸及其類似物過度刺激突觸后受體，其中最主要的是谷氨酸過度刺激N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體所引起的神經(jīng)細(xì)胞變性和壞死。在神經(jīng)損傷過程中,氧化應(yīng)激和興奮性毒性可同時或相繼發(fā)生,也可相互加強(qiáng),有時又可彼此獨立，在生理情況下,腦內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)可使活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的生成量處于無害水平,在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的Na+依賴性高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體把胞外Glu水平限制在正常的生理濃度約為 1 mol/L。當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生缺血缺氧等改變時,能量供應(yīng)不能滿足需要,腦內(nèi)抗氧化防御功能和谷氨酸轉(zhuǎn)運體功能均可受損,另外有些外來化合物甚至直接促進(jìn)腦內(nèi)ROS生成,破壞抗氧化防御功能,使ROS凈產(chǎn)量過高,或直接抑制谷氨酸高親和力轉(zhuǎn)運體,促進(jìn) Glu的囊泡釋放或非特異流出,使胞外Glu 濃度過高,過度刺激突觸后的Glu受體,或促進(jìn)Glu受體結(jié)合,增加Glu受體的敏感性,出現(xiàn)氧化應(yīng)激和興奮性毒性。

越來越多的證據(jù)表明大麻素可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)保護(hù)作用，如在阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病的神經(jīng)保護(hù)潛力研究。對大麻素系統(tǒng)生理學(xué)和藥理學(xué)作用的深入研究增加了大麻素作為潛在治療靶點的興趣。并且已經(jīng)在免疫系統(tǒng)細(xì)胞和腦膠質(zhì)細(xì)胞中檢測到大麻素受體及其內(nèi)源性配體。許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有與興奮性毒性、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥相關(guān)的神經(jīng)退行性成分，在腦外傷后或在其他病理條件下在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中CB2受體的表達(dá)增加，以促穩(wěn)態(tài)的方式調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)功能。CB2受體激活可在多個層面發(fā)揮作用促進(jìn)神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)和存活：對于神經(jīng)元，CB2受體激活可通過抑制興奮毒性、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用；在星形膠質(zhì)細(xì)胞，CB2受體激活可通過促進(jìn)抗炎介質(zhì)如白細(xì)胞介素-10等生成等機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用 ;在小膠質(zhì)細(xì)胞和其他入侵的免疫細(xì)胞中，CB2受體激活可調(diào)控其在細(xì)胞遷移和細(xì)胞因子產(chǎn)生來限制炎癥反應(yīng)。另外，CB2受體激活可減緩多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展，在Cakir等[18]的研究中，CB2受體激動劑 JWH-133 可減輕阿爾茨海默病模型中的神經(jīng)變性、神經(jīng)炎癥和空間記憶障礙。在Javed等[19]的研究中，CB2受體激活可部分逆轉(zhuǎn)帕金森病模型中魚藤酮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激以及與神經(jīng)炎癥相關(guān)的多巴胺能神經(jīng)元變性。在Alcigir等[20]的研究中，CB2受體激活還可減輕幼年小鼠甲狀腺功能減退誘發(fā)的腦氧化應(yīng)激損傷。

本研究所得結(jié)果中，激活CB2受體后，胞外谷氨酸的損傷減輕，培養(yǎng)基中LDH活性和MDA含量下降，HT22細(xì)胞SOD活性升高，CB2受體拮抗劑AM630可逆轉(zhuǎn)CB2受體激動劑對谷氨酸損傷的保護(hù)作用并使培養(yǎng)基中LDH活性和MDA含量升高，HT22細(xì)胞SOD活性下降，提示激活CB2受體減輕谷氨酸毒性損傷可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

綜上所述，CB2受體激活減輕谷氨酸誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元損傷，其機(jī)制與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。