右美托咪定對(duì)老年小鼠海馬和杏仁核半胱氨酸蛋白酶-3基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

鄭 凌，張霞靖，劉 倩

(西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004)

當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)老化時(shí)，其可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)意識(shí)水平、精神狀況、注意力的下降，并且可長(zhǎng)期存在與反復(fù)發(fā)作，從而影響患者生活質(zhì)量的下降，誘發(fā)老年癡呆的發(fā)生[1-2]。降低老年人認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率，可有效延長(zhǎng)老年人的生活質(zhì)量[3]。在顱內(nèi)腦組織中，海馬和杏仁核組織是學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要部位，特別是認(rèn)知功能障礙患者的海馬和杏仁核組織可受到傷害，可直接影響去甲腎上腺素能和多巴胺能神經(jīng)的含量，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶功能障礙。右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)是一種高選擇性的α2受體激動(dòng)劑，可導(dǎo)致交感神經(jīng)系統(tǒng)遲鈍，可抑制去甲腎上腺素的釋放，從而產(chǎn)生抗焦慮、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用[4-5]。同時(shí)其也可通過(guò)激活藍(lán)斑核α2腎上腺素受體，模擬“自然睡眠”效應(yīng)，產(chǎn)生劑量依賴(lài)性鎮(zhèn)靜作用，當(dāng)前在臨床上的應(yīng)用比較多見(jiàn)[6]。有研究顯示激活α2腎上腺素受體的表達(dá)可影響大鼠在水迷宮中的空間導(dǎo)航能力，而阻滯該受體的表達(dá)則可增強(qiáng)大鼠的記憶能力[7]。還有研究顯示右美托咪定可與通過(guò)下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元環(huán)路下游γ-氨基丁酸受體進(jìn)行結(jié)合，從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用[8]。并且右美托咪定可在神經(jīng)系統(tǒng)遭受創(chuàng)傷時(shí)抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)，降低老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡并減少氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。本文具體探討了右美托咪定對(duì)老年小鼠海馬和杏仁核半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)基因表達(dá)的影響，以明確右美托咪定的作用效果與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 48只老年(18月齡)SPF級(jí)健康雄性SD小鼠(體重400～550 g)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，并飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的SPF級(jí)動(dòng)物房(合格證批號(hào):23981333)。所有小鼠可自由進(jìn)食進(jìn)水，在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行飼養(yǎng)，自然晝夜光線(xiàn)照明，室溫18～22 ℃。操作過(guò)程符合動(dòng)物倫理要求，通風(fēng)良好，研究也得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

右美托咪定購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字:H20090248)，抗β-actin抗體、蛋白裂解液、蛋白定量試劑盒等購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Caspase-3抗體購(gòu)自Abcam公司，舒芬太尼購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司(國(guó)藥準(zhǔn)字:H20054171)，小動(dòng)物麻醉劑與無(wú)菌縫線(xiàn)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。ZH0065型Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)購(gòu)自北京碩林苑科技有限公司，Caspase-3基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，血清去甲腎上腺素試劑盒、腦血紅蛋白購(gòu)自Cusabio公司。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠分組與干預(yù)：將所有小鼠隨機(jī)平分為三組：對(duì)照組、舒芬太尼組與右美托咪定組，所有大鼠給予正常飼養(yǎng)。舒芬太尼組與右美托咪定組：分別給予5 μg/kg舒芬太尼與5 μg/kg右美托咪定進(jìn)行腹腔注射。對(duì)照組：給予等容量0.9% 氯化鈉溶液腹腔注射。每周1次，持續(xù)8周。

1.2.2 觀察指標(biāo)： ①所有大鼠在干預(yù)第4周與第8周進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 d訓(xùn)練小鼠站臺(tái)，實(shí)驗(yàn)期間保持安靜無(wú)人的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后記錄小鼠在120 s內(nèi)的逃避潛伏期(找到平臺(tái)時(shí)間)，同時(shí)記錄小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)與處于平臺(tái)所在象限時(shí)間。采用北京碩林苑科技有限公司的自帶視頻跟蹤軟件輸出小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。②在干預(yù)第4周與第8周取小鼠的尾靜脈血0.2～0.5 ml，低溫離心后分離上層血清，采用免疫發(fā)光法檢測(cè)血清去甲腎上腺素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。③在干預(yù)第8周處死所有小鼠，剝離出完整腦組織后，冰上剝離取出海馬和杏仁核組織，充分研磨后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后采用qPCR法檢測(cè)Caspase-3基因表達(dá)水平，以β-actin作為基因內(nèi)參，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。④取上述的小鼠海馬和杏仁核組織，充分研磨后，用蛋白裂解液裂解海馬組織并提取全蛋白，定量蛋白濃度后，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶室溫下封閉30 min，加入抗Caspase-3抗體(稀釋度為1∶2000)，室溫孵育30 min后4 ℃放置過(guò)夜，TBST洗膜3×10 min次，然后加入二抗，室溫1 h，TBST洗膜3×10 min次，采用ECL Western Blot Kit 進(jìn)行暗室顯影，以β-actin為參照，用Image J軟件量化相對(duì)灰度值，為此判定目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 三組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)水迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較 舒芬太尼組與右美托咪定組干預(yù)第4周與第8周的逃避潛伏期低于對(duì)照組(均P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)與處于平臺(tái)所在象限時(shí)間高于對(duì)照組(均P<0.05)，兩組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)水迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較

2.2 三組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、去甲腎上腺素含量比較 舒芬太尼組與右美托咪定組干預(yù)第4周與第8周的血清去甲腎上腺素含量高于對(duì)照組(均P<0.05)，TNF-α含量低于對(duì)照組(均P<0.05)，兩組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 三組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、去甲腎上腺素含量比較(pg/ml)

2.3 三組干預(yù)第8周海馬和杏仁核Caspase-3基因表達(dá)水平比較 舒芬太尼組與右美托咪定組干預(yù)第8周的海馬和杏仁核Caspase-3基因表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 三組干預(yù)第8周海馬和杏仁核Caspase-3基因表達(dá)水平比較

2.4 三組干預(yù)第8周海馬和杏仁核Caspase-3蛋白表達(dá)水平對(duì)比 舒芬太尼組與右美托咪定組干預(yù)第8周的海馬和杏仁核Caspase-3蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 三組干預(yù)第8周海馬和杏仁核Caspase-3蛋白表達(dá)水平對(duì)比

3 討 論

隨著軀體的老年化，很多老年人伴隨有認(rèn)知功能障礙，在臨床上的特征為認(rèn)知功能逐漸下降，各種神經(jīng)系統(tǒng)的異常。在病理上表現(xiàn)為應(yīng)激性毒性副產(chǎn)物的蓄積，大腦神經(jīng)元的減少，使得大腦的應(yīng)激能力下降[10]。舒芬太尼為臨床上的常見(jiàn)麻醉鎮(zhèn)靜藥物，有利于緩解老年患者的認(rèn)知功能障礙情況，但是對(duì)于老年人有一定的成癮性。右美托咪定雖然能夠致交感神經(jīng)系統(tǒng)遲鈍，從而產(chǎn)生相應(yīng)的鎮(zhèn)靜與抗焦慮作用，但是其起效迅速，清除率快且?guī)缀鯇?duì)呼吸無(wú)影響。并且右美托咪定能減輕機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)紊亂等情況，可抑制多種因素導(dǎo)致的腦組織炎性反應(yīng)，如缺氧導(dǎo)致的鼠腦損傷、缺血再灌注損傷導(dǎo)致的炎性反應(yīng)等。本文采用的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)配套有電腦系統(tǒng)，可同步自動(dòng)記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡及尋找平臺(tái)的時(shí)間等，更加有利于進(jìn)行認(rèn)知功能的判斷。本研究顯示舒芬太尼組與右美托咪定組干預(yù)第4周與第8周的逃避潛伏期低于對(duì)照組(均P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)與處于平臺(tái)所在象限時(shí)間高于對(duì)照組(均P<0.05)，舒芬太尼組與右美托咪定組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明右美托咪定在老年小鼠的應(yīng)用能改善認(rèn)知狀況。當(dāng)前有研究表明右美托咪定可改善重癥創(chuàng)傷應(yīng)激小鼠的血腦屏障通透性，從而有利于小鼠的認(rèn)知功能恢復(fù)[11]。本文顯示右美托咪定組第4周與第8周的海馬組織去甲腎上腺素含量都顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)，說(shuō)明右美托咪定的應(yīng)用能有效拮抗海馬內(nèi)去甲腎上腺素的含量下降情況，使得去甲腎上腺素能投射系統(tǒng)增加，影響下游神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制。

衡量人類(lèi)智能發(fā)育的重要指標(biāo)就是學(xué)習(xí)記憶，去甲腎上腺素是最早被發(fā)現(xiàn)的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)。隨著老齡化的發(fā)展，伴隨有海馬去甲腎上腺素含量減少和血清TNF-α含量增加，可使得機(jī)體記憶能力受到損傷。右美托咪定能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性和環(huán)磷腺苷(Cyclophosphine adenosine，cAMP)的合成，導(dǎo)致突觸活動(dòng)減少，產(chǎn)生突觸前抑制，可影響下游神經(jīng)遞質(zhì)釋放。右美托咪定也具有抗神經(jīng)興奮毒性、鎮(zhèn)靜、抑制交感活性、抗炎等多種作用，是臨床上安全有效的麻醉輔助藥品，具有神經(jīng)元保護(hù)作用[12-13]。本研究顯示舒芬太尼組與右美托咪定組干預(yù)第4周與第8周的血清去甲腎上腺素含量高于對(duì)照組(均P<0.05)，TNF-α含量低于對(duì)照組(P<0.05)，舒芬太尼組與右美托咪定組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明右美托咪定在老年小鼠的應(yīng)用能抑制TNF-α的釋放，提高血清去甲腎上腺素含量。還有研究顯示，作為一種α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，右美托咪定具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、催眠等綜合藥理作用，可降低重大創(chuàng)傷術(shù)后炎性反應(yīng)和認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[14-15]。

抑制腦組織的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)神經(jīng)元的功能，右美托咪定可激活位于藍(lán)斑核的腎上腺素受體，能抑制腦組織的細(xì)胞凋亡，從而降低神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率[16]。右美托咪定還可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少麻醉手術(shù)后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，下調(diào)NF-κB 通路，降低海馬組織TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，減少認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[17]。本研究顯示舒芬太尼組與右美托咪定組干預(yù)第8周的海馬和杏仁核Caspase-3基因、蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，舒芬太尼組低于右美托咪定組(P<0.05)，表明右美托咪定在老年小鼠的應(yīng)用能抑制海馬和杏仁核Caspase-3基因、蛋白的表達(dá)。還有研究顯示右美托咪定可降低Casepase-3蛋白表達(dá)量，從而減少機(jī)體麻醉手術(shù)后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，從而改善機(jī)體的認(rèn)知功能[18-19]。本研究也存在一定的不足，大鼠數(shù)量較少，分組也比較少，也沒(méi)有進(jìn)行劑量分析，機(jī)制分析還不明確，將在后續(xù)研究中深入探討。

綜上所述，右美托咪定在老年小鼠的應(yīng)用能抑制海馬和杏仁核Caspase-3基因與蛋白表達(dá)，也可抑制TNF-α的釋放，提高血清去甲腎上腺素含量，從而有利于小鼠的認(rèn)知功能恢復(fù)。