脂肪間充質(zhì)干細胞對小鼠創(chuàng)面組織超氧化物歧化酶及血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子表達的影響

左 楠，崔 莉，王 爽

(1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院 西安市第三醫(yī)院皮膚科, 陜西 西安 710018；2.陜西省人民醫(yī)院皮膚科,陜西 西安 710068；3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科,陜西 西安710004)

創(chuàng)面愈合一直以來是整形外科和燒傷外科常見的問題，對于較為淺表創(chuàng)面的皮膚全層缺損，可以通過促進殘留皮膚附件內(nèi)的干細胞再生愈合[1]。對于較為深層的創(chuàng)面，臨床上多采用皮瓣移植進行修復(fù)。但因為其取材大小受限，取材后可能會給供體部位造成負面影響；且供區(qū)皮膚來源以及免疫排斥問題也限制了其有效的應(yīng)用[2-3]。細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)膠Matrigel是一種可溶性的基底膜基質(zhì)，具有良好的可注射性和組織相容性，包括成纖維生長因子、層黏連蛋白組織纖維酶原活化因子等，可為干細胞提供不被體內(nèi)退變微環(huán)境損傷的三維支持[4]。干細胞移植已成為近年來創(chuàng)面再生修復(fù)的研究熱點之一，與其他的干細胞相比較，脂肪間充質(zhì)干細胞(Human adipose dervied stem cells，hASCs)具有容易獲得、獲取效率高、可跨胚層多向分化、獲取過程中造成損傷小、增殖速度快等特點[5-6]。hASCs具有多向分化潛能，也能夠自我復(fù)制，能夠分化為同為中胚層的成骨細胞、軟骨細胞等，提示在創(chuàng)面愈合中可能存在重要的價值[7-8]。本研究探討hASCs促進小鼠創(chuàng)面愈合的作用?，F(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物： 裸鼠24只(6～8周齡，雌性，體重18～22 g，6～8周齡)，購自實驗動物中心(批號：23882814)。于SPF實驗部飼養(yǎng)，室溫控(23±3)℃，相對濕度50%，采用高壓滅菌后的專用裸鼠飼料(北京維通利華有限公司)喂食，飼養(yǎng)在正常晝夜環(huán)境中(光照12 h/d)，飲用水為純凈水。本研究所有動物操作都符合倫理要求，且研究得到了動物倫理委員會的批準。

1.1.2 實驗試劑：hASCs與Matrigel都由本實驗室保存(批號：7777214、2874888)，胎牛血清、TritonX-100、DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶等試劑都購自Sigma公司(美國，批號分別為184822、1842662、2876429、3145552)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠創(chuàng)面愈合的建立：采用腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)對裸鼠進行全身麻醉，使用75%乙醇消毒裸鼠背部皮膚3遍，并將2個消毒后的聚酯膠圈(將內(nèi)徑6 mm、外徑10 mm的聚酯膠軟管修剪為厚度為1 mm的聚酯膠圈)置于裸鼠脊椎兩側(cè)的背部皮膚上并固定。全層裸鼠皮膚及其肉膜使用眼科剪沿膠圈內(nèi)側(cè)剪除，并暴露肌肉層，制備出圓形皮膚缺損(2個直徑4 mm)。創(chuàng)面使用無菌不透水敷料覆蓋，術(shù)后裸鼠單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組與處理：把建模后的裸鼠隨機分為三組，每組8只。實驗組：將hASCs以1×107的密度接種于Matrigel，調(diào)整hASCs濃度，每只裸鼠注射400 μl(含有1.5×105個hASCs)。細胞組：每只裸鼠注射400 μl(含有1.5×105個hASCs)，不接種于Matrigel。對照組：每只裸鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面處注射400 μl磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)。上述注射治療1次/d，持續(xù)7 d。

1.2.3 觀察指標：①在術(shù)后7、14 d觀察創(chuàng)面，創(chuàng)面愈合為新生填充組織填充缺損、創(chuàng)面完整的再上皮化。創(chuàng)面愈合率(%)×[(原始創(chuàng)面面積-檢測時的創(chuàng)面面積)÷原始創(chuàng)面面積]=×100%。②在術(shù)后7、14 d進行創(chuàng)面取材，包括創(chuàng)面中心和周圍皮膚進行分析，用組織均漿器制成100 g/L的組織均漿，在-10 ℃ 3500 r/min的條件下離心20 min，采用連苯三酚自氧化法檢測超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)水平，采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平。③術(shù)后14 d處死裸鼠，取眼球血液0.5 ml，分離血清，血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)及堿性成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor，bFGF)表達水平用酶聯(lián)免疫法檢測。同時取材后行創(chuàng)面組織切片并行MASON染色。

2 結(jié) 果

2.1 三組不同時間點創(chuàng)面愈合率比較 所有裸鼠都造模成功，無動物因麻醉或手術(shù)而死亡。實驗組與細胞組術(shù)后7 d與14 d的創(chuàng)面愈合率顯著高于對照組，實驗組也顯著高于細胞組(均P<0.05)，見表1。

表1 三組不同時間點創(chuàng)面愈合率比較(%)

2.2 三組不同時間點創(chuàng)面組織SOD與MDA水平比較 對實驗組與細胞組術(shù)后7 d與14 d創(chuàng)面組織的SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低(均P<0.05)，且實驗組與細胞組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組不同時間點創(chuàng)面組織SOD與MDA水平比較

2.3 三組術(shù)后14 d血清細胞因子表達水平比較 實驗組與細胞組術(shù)后14 d的血清VEGF、EGF、bFGF表達水平顯著升高(均P<0.05)，且實驗組與細胞組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組術(shù)后14 d血清細胞因子表達水平比較(ng/ml)

2.4 三組MASSON染色特征比較 實驗組創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合，表皮修復(fù)情況良好，可見部分炎性細胞浸潤，呈復(fù)層上皮排列。細胞組：已修復(fù)部分的表皮修復(fù)情況良好，表皮呈復(fù)層上皮排列，仍有部分創(chuàng)面未能愈合，肉芽組織生長良好。對照組：尚未愈合的創(chuàng)口周圍可見有瘢痕組織增生，可見炎性細胞浸潤較明顯，仍有相當(dāng)一部分創(chuàng)面尚未能愈合(圖1)。

對照組 實驗組 細胞組

3 討 論

皮膚作為人體最大的器官，覆蓋于全身表面，約占全身體重的16%，含有復(fù)雜的血管和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，有一定的自我修復(fù)功能。皮膚組織大多數(shù)由機械傷、燒傷和爆炸傷等原因造成，其愈合和修復(fù)涉及多個因素，包括細胞增殖、細胞外基質(zhì)生成和炎癥反應(yīng)等，是一個整體且復(fù)雜的過程。以往的組織修復(fù)通過將有創(chuàng)傷的移植方式把相關(guān)移植物植入到體內(nèi)，再進行修復(fù)缺損組織，雖然有一定的成功率，但是修復(fù)過程復(fù)雜，在修復(fù)后多伴隨有后遺癥[9-10]。

干細胞移植已成為近年來創(chuàng)面再生修復(fù)的研究熱點之一。骨髓間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞等應(yīng)用比較多，但由于上述兩種細胞涉及取材困難、免疫排斥及法律道德等方面的問題，其應(yīng)用受到了限制[11-12]。hASCs是一類間充質(zhì)干細胞，存在于脂肪組織中，其具有多項分化潛能，能夠分化為不同胚層來源的細胞。另外，hASCs是一種較為理想的組織工程種子細胞，其具有多項優(yōu)點，即不涉及倫理問題、干細胞得率高、易采集和來源廣等[13-14]。hASCs具有多向分化潛能，是組織修復(fù)良好的種子細胞，可以向其他胚層來源的細胞分化，能夠有效提高機體的愈合能力。但是在干細胞注射過程中，組織的局部缺血和炎癥反應(yīng)的微環(huán)境等均可造成細胞增殖活性下降，導(dǎo)致治療效果下降。Matrigel是一種可溶性的基底膜基質(zhì)，內(nèi)含多種細胞因子，可注射性和組織相容性都較好，可為干細胞增殖提供三維支持[15]。本研究顯示所有裸鼠都造模成功，無動物因麻醉或手術(shù)而死亡；實驗組與細胞組術(shù)后7 d與14 d的創(chuàng)面愈合率顯著高于對照組，術(shù)后14 d實驗組與細胞組的血清VEGF、EGF、bFGF表達水平顯著對照組(均P<0.05)，實驗組也顯著高于細胞組(P<0.05)，說明hASCs接種于Matrigel可促進小鼠創(chuàng)面愈合，也有利于細胞因子的表達。VEGF、EGF、bFGF可以通過促進血漿蛋白在局部沉積為組織再生和新生血管長入提供細胞外基質(zhì)，能促進局部微循環(huán)血管網(wǎng)的建立和成骨細胞的生長，誘導(dǎo)成骨細胞向壞死區(qū)轉(zhuǎn)移。VEGF、EGF、bFGF其表達水平可有效反映骨組織的生理狀態(tài)，VEGF、EGF、bFGF表達水平越高，創(chuàng)面愈合能夠越強[16]。從機制上分析，Matrigel配合hASCs能夠更持久更有效地發(fā)揮；其也可構(gòu)建一種有效的可注射的三維微環(huán)境，減少創(chuàng)面微環(huán)境中因各種因素造成hASCs的流失、凋亡，進一步促進創(chuàng)面愈合[17-18]。

創(chuàng)面愈合本質(zhì)是創(chuàng)面重建的過程，在此過程中涉及局部微環(huán)境的構(gòu)建、血管的生成等。hASCs來源廣泛，可以從自體或異體獲得，易于分離、培養(yǎng)，經(jīng)過基因技術(shù)加工后生物學(xué)特性也比較好。hASCs也能促進血管重建、再上皮化及創(chuàng)面收縮，促進肉芽組織沉積，減輕炎癥反應(yīng)，能分化為血管內(nèi)皮細胞和表皮細胞，促使促進創(chuàng)面愈合[19]。本研究顯示實驗組與細胞組術(shù)后7 d與14 d創(chuàng)面組織的SOD水平顯著高于對照組(P<0.05)，MDA水平顯著低于對照組(P<0.05)，且實驗組和細胞組對比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，表明hASCs的應(yīng)用能減輕創(chuàng)面氧化應(yīng)激反應(yīng)。特別是Matrigel配合hASCs可以很大程度的增強創(chuàng)面的修復(fù)能力，能促進分泌相關(guān)生長因子，幫助皮膚成纖維細胞的遷移，也可幫助刺激膠原的分泌和組織，從而增強創(chuàng)面修復(fù)水平[20]。當(dāng)前也有研究將hASCs接種到具Matrigel中，當(dāng)形成hASCs/Matrigel復(fù)合物后，移植至裸鼠背部的全層皮膚缺損創(chuàng)面，能夠有效的將hASCs維持在創(chuàng)面的局部微環(huán)境中，從而促進創(chuàng)面愈合[20]。本研究也有一定的不足，hASCs也存在一定的免疫排斥性，導(dǎo)致實際臨床應(yīng)用效果可能不佳；且hASCs/Matrigel復(fù)合物為外源性物質(zhì)，在實際應(yīng)用中可能受到限制；本研究樣本數(shù)量也不足，將在后續(xù)研究中深入分析。

綜上所述，Matrigel復(fù)合hASCs在小鼠創(chuàng)面中的應(yīng)用能促進細胞因子的分泌，抑制創(chuàng)面的氧化應(yīng)激作用，從而促進創(chuàng)面愈合。