蒲公英甾醇對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷保護作用及其機制

陳 爽，唐笑梅，麻昊陽

（南京醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，江蘇南京 210029）

急 性 腎 損 傷（acute kidney injury，AKI）是 一種常見的臨床綜合征，其發(fā)病率高且呈逐年上升趨勢。2015年一項橫斷面研究表明，我國住院病人AKI檢出率高達2%，預(yù)測有290萬AKI病人住院治療，約有70萬患者死于AKI[1]，而且存活的患者也易進展至慢性腎病乃至終末期腎臟病[2]。研究證實，急性腎小管壞死是AKI 發(fā)生最常見的原因[3]。在疾病狀態(tài)下，腎小管上皮細胞對缺血缺氧、毒素等刺激非常敏感，極易受到損傷，發(fā)生變性、凋亡、壞死、脫落[4]。蒲公英甾醇是一種從蒲公英中分離出來的五環(huán)三萜成分，以往的研究顯示其發(fā)揮著較好的抗炎作用[5-7]。中性粒細胞明膠酶相關(guān)的脂蛋 白 (Neutrophil gelatinase-associated lipoealin，NGAL)已被確定為早期檢測AKI的有效的生物標(biāo)志物，有研究表明，AKI患者的NGAL水平在可檢測到的血清肌酐升高前24～48 h即顯著升高[8]。本研究探討蒲公英甾醇是否通過抑制炎癥進而改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷，為臨床治療急性腎損傷提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級C57/B6小鼠 雄性C57/B6小鼠24只，年齡8周，體質(zhì)量22～25 g，購于維通利華實驗動物中心（合格證編號：20210416Abzz0600000683；倫理編號：IACUC-2007001）

1.2 試劑 蒲公英甾醇(純度99.9%，成都瑞芬思生物科技有限公司，貨號：1059-14-9)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國Novus Biological公司)。凍干型注射用順鉑（山東齊魯制藥，國藥準(zhǔn)字H20023461，規(guī)格：凍干粉：20 mg）。GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)多克隆抗體（武漢塞維爾生物科技）。ECL顯色試劑盒（上海天能公司，貨號：180-5001）。Trizol、cDNA一鏈合成試劑盒（日本Takara公司，貨號：6210A）。qRT-PCR試劑盒（中國諾維贊生物技術(shù)有限公司，貨號：Q221-01）。PAGE凝膠制備試劑盒（上海雅酶，貨號：PG112）。

2 實驗方法和步驟

2.1 動物模型的制備 將小鼠置于SPF級動物房飼養(yǎng)1周（小鼠自由飲水?dāng)z食，室溫約25°C，濕度約50%）。隨機分為 3 組：空白組（n=8）、順鉑組（CP）（n=8）、蒲公英甾醇+順鉑組（干預(yù)）（n=8）。于造模前24 h給與干預(yù)組蒲公英甾醇（10 mg/kg），腹腔注射，固定時間點每日一次直至實驗結(jié)束。其余兩組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，直至實驗結(jié)束。蒲公英甾醇預(yù)治療24 h后，給予CP組和蒲公英甾醇+順鉑組一次性腹腔注射順鉑22 mg/kg，誘導(dǎo)急性腎損傷，其余小鼠腹腔注射等量生理鹽水。每日記錄小鼠精神狀況及體質(zhì)量。于注射順鉑72 h后處死小鼠，經(jīng)心臟采血，并留取雙側(cè)腎臟組織樣本。

2.2 石蠟標(biāo)本制作與過碘酸雪夫染色（PAS）染色 新鮮腎臟組織置于4%多聚甲醛中，固定24～48 h，經(jīng)脫水，包埋后切片（3 μm）。于65 ℃烘箱中烘烤40 min后保存于切片盒。將石蠟切片放至65 ℃烘箱烘烤1 h直至石蠟熔化，經(jīng)脫蠟、乙醇梯度水化后置于1%過碘酸氧化10 min（37 ℃），雙蒸水充分洗滌，擦干水分放入Schiff氏液，浸泡40 min，自來水沖洗30 min，蘇木素染細胞核1 min。1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗，返藍后流水沖洗。梯度乙醇脫水、透明、封片，然后進行鏡下觀察。

2.3 腎組織小管損傷評分 選用PAS染色病理切片，在顯微鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)，每張切片隨機選取20個皮質(zhì)區(qū)視野（×200），觀察4種主要的急性腎損傷相關(guān)表現(xiàn)（腎小管上皮細胞變性，腎小管的腫脹、剝脫，管形形成，刷狀緣丟失），其評分標(biāo)準(zhǔn)如下[9]，在任意腎單位中小管損傷所占比例：①正常腎小管：0分；②損傷＜25%：1分；③25%＜損傷＜50%：2分；④50%＜損傷＜75%：3分；⑤損傷＞75%：4分。

2.4 血清肌酐、尿素氮檢測 小鼠麻醉后，經(jīng)心臟采血留取小鼠血液，并用抗凝管收集小鼠血液。離心5 000 r/min（20 min），吸取上清，置于 -80 ℃冰箱保存。吸取70 μL上清并用140 μL生理鹽水稀釋3倍（加樣過程中切勿產(chǎn)生氣泡），采用生化分析儀（羅氏公司，型號：cobas8000）檢測血肌酐（Scr）及尿素氮（BUN）水平。

2.5 腎臟組織NGAL mRNA表達水平的檢測 取腎臟組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，QPCR檢測NGAL表達水平。引物序列如下：

2.6 腎臟組織NGAL蛋白表達水平的檢測 取腎臟組織加入組織蛋白提取液，勻漿后按照二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒方法測定蛋白濃度，加入SDSPAGE蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer，5X)，沸水水浴10 min，配制10%的分離膠和12%的濃縮膠，加樣，65 V，電泳45 min之后改為130 V恒壓電泳的方法電泳；當(dāng)溴酚藍指示電泳到達底部或者根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量的大小，判斷是否停止電泳。隨后轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗孵育，用凝膠成像系統(tǒng)成像，進行灰度分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以（±s）表示，使用one-way ANOVA分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 3組小鼠血尿素氮和血肌酐水平比較 順鉑組相較于空白組BUN(18.30±0.32 mmol/L，57.75±0.65 mmol/L)及SCr(19.79±0.49，80.03±0.95 μmol/L)水平均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；蒲公英甾醇處理后的干預(yù)組小鼠相較于順鉑組血清BUN(36.55±0.38 mmol/L，57.75±0.65 mmol/L) 及 Scr(39.65±0.62 μmol/L，80.03±0.95 μmol/L)水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖1A、1B。

圖1 3組小鼠血尿素氮和血肌酐水平比較

3.2 3組小鼠腎小管損傷情況比較 PAS染色發(fā)現(xiàn)，由順鉑引起的腎小管上皮細胞腫脹、剝脫及壞死，腎小管擴張及管形形成，基底膜刷狀緣消失等病理改變在蒲公英甾醇干預(yù)組均得到顯著改善（見圖2A），與腎功能改善的結(jié)果一致。應(yīng)用腎小管損傷評分對過碘酸雪夫染色（PAS）染色進行半定量分析，空白組小管評分為0，順鉑組小鼠的小管評分顯著高于蒲公英甾醇干預(yù)組（26.00±0.96，13.13±1.63）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖2B。

圖2 3組小鼠腎小管損傷情況比較

3.3 3組小鼠炎癥反應(yīng)水平比較 ELISA結(jié)果顯示，與空白組相比，順鉑組小鼠血清TNF-α和IL-6的水平均升高，經(jīng)蒲公英甾醇干預(yù)后TNF-α和IL-6的水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 3組小鼠炎癥反應(yīng)水平比較

3.4 3組小鼠NGAL水平比較 順鉑組小鼠NGAL水平高于空白組，經(jīng)蒲公英甾醇干預(yù)后可降低順鉑誘導(dǎo)的AKI模型小鼠中NGAL的mRNA和蛋白質(zhì)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠NGALmRNA和蛋白質(zhì)水平

4 討論

急性腎損傷(AKI)是由多種病因引起的腎功能快速下降而出現(xiàn)的復(fù)雜臨床綜合征，其發(fā)病率逐年上升，病死率居高不下，是腎臟病中的急危重癥。近年研究證明，AKI是引起慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的重要原因，AKI 增加了CKD的風(fēng)險[10]。而多項研究表明炎癥在AKI向CKD轉(zhuǎn)變的進程中發(fā)揮重要作用，AKI引發(fā)的炎性反應(yīng)可激活炎癥信號通路[11]，進一步導(dǎo)致腎臟損傷移至纖維化的發(fā)生。因此，當(dāng)AKI發(fā)生后，有效的控制炎癥對治療AKI及抑制AKI向CKD的進展有重要意義。

既往在對小鼠酒精性和免疫性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇能夠顯著降低炎性介質(zhì)白細胞介素-1β、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子-a、γ干擾素等水平，從而對酒精性肝損傷和伴刀豆球蛋白誘導(dǎo)的免疫性肝臟損傷起保護作用[12]。而在乳腺炎的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)蒲公英甾醇可降低大鼠iNOS和COX-2 mRNA表達，抑制NF-κB、MAPKs信號通路和促炎細胞因子的產(chǎn)生，對乳腺炎發(fā)揮抗炎作用[13]。蒲公英甾醇可能通過TGF-/Smad通路對小鼠耳廓痤瘡模型發(fā)揮治療作用，調(diào)節(jié)炎性因子的表達、改善小鼠胸腺組織形態(tài)[14]。本實驗結(jié)果表明，在順鉑誘導(dǎo)的AKI模型中，順鉑會導(dǎo)致腎小管細胞損傷，壞死，誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)。而使用蒲公英甾醇干預(yù)可有效降低順鉑誘導(dǎo)的AKI模型小鼠腎臟組織TNF-α、IL-6的水平，緩解炎性反應(yīng)，使得腎小管上皮細胞變性，腎小管的腫脹、剝脫，管形形成，刷狀緣丟失等損傷顯著減輕，改善腎臟結(jié)構(gòu)與功能。NGAL是一種敏感的腎小管損傷標(biāo)志物。我們通過QPCR和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)蒲公英甾醇可降低順鉑誘導(dǎo)的AKI模型小鼠NGAL的mRNA和蛋白質(zhì)水平。表明蒲公英甾醇在損傷發(fā)生時可通過抑制炎癥因子的表達，發(fā)揮抗炎作用，進而減輕腎臟損傷。

綜上所述，本研究探討了腎臟疾病中蒲公英甾醇對AKI的影響，在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型里，發(fā)現(xiàn)蒲公英甾醇可通過減輕炎癥反應(yīng)進而減輕腎臟損傷，為急性腎損傷的治療提供新思路。