8株奶牛乳房炎鏈球菌的分離鑒定與耐藥性分析

王 慧，劉伯承，楊 俊，杜麗飛,2，彭苗苗,2，劉俊琦，王紅兵

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙410131；2.湖南鑫廣安農(nóng)牧股份有限公司，湖南長(zhǎng)沙410129）

乳房炎是造成奶牛業(yè)損失最多的全球性奶牛疾病，常導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降。引起奶牛乳房炎的因素復(fù)雜多樣，其中病原菌感染尤為普遍，目前報(bào)道的已有80余種，其中鏈球菌是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌之一。以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和化膿鏈球菌等最為常見[1]。據(jù)報(bào)道，鏈球菌所致的奶牛乳房炎臨床癥狀不明顯，容易被忽視，從而造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，隨著抗生素的普遍使用甚至濫用，造成藥物治療無效。因此，定期進(jìn)行病原菌的分離鑒定及耐藥分析極其重要。實(shí)驗(yàn)研究了奶牛隱性乳房炎中鏈球菌的分布及耐藥性，為該牛場(chǎng)在治療奶牛乳房炎時(shí)選擇藥物及后期的防控工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（自配）、綿陽血瓊脂平皿（購自長(zhǎng)沙市寶生盾生物科技有限公司）；

1.1.2 實(shí) 驗(yàn) 試 劑：藥 敏 紙 片、mark2000、PCR Master Mix、GelRed核酸染料、電泳液、瓊脂糖，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，均購自長(zhǎng)沙市寶生盾生物科技有限公司；16s RNA通用引物，由華大基因合成。

1.1.3 病料來源：試驗(yàn)所用菌株來自湖南地區(qū)某奶牛場(chǎng)，采集疑似隱性乳房炎的患牛乳汁并分離到的8株鏈球菌。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳房炎判斷標(biāo)準(zhǔn)：牛乳體細(xì)胞數(shù)（SCC）推薦分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照國際乳業(yè)聯(lián)合會(huì)（IDF）的規(guī)定，其中SCC＜50萬個(gè)/mL為健康奶牛；100萬個(gè)/mL＞SCC＞50萬個(gè)/mL為隱性乳房炎；SCC＞100萬個(gè)/mL為臨床型乳房炎[2]。

1.2.2 鏈球菌的分離純化：將送檢乳樣無菌接種于綿羊血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察是否有菌落生長(zhǎng)并挑取可疑單個(gè)菌落進(jìn)行傳代純化，純化后再將單個(gè)菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，獲得純菌株增菌液。

1.2.3 鏈球菌的PCR測(cè)序鑒定：對(duì)所純化細(xì)菌用16s RNA（27F/1492R）通用引物進(jìn)行擴(kuò)增,序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1500bp左右。挑取純培養(yǎng)后的細(xì)菌于滅菌純水中混勻，于100℃水浴10分鐘，再置于冰塊10分鐘以上，然后離心取上清液即為病原菌的基因組作為PCR模板，進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，進(jìn)行基因測(cè)序后Blast比對(duì)。

1.2.4 鏈球菌的藥物敏感性試驗(yàn)：采用K-B紙片擴(kuò)散法，對(duì)分離出的主要病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照CLSI推薦的肉湯稀釋法及標(biāo)準(zhǔn)[3]判斷其耐藥性。選用的藥物有氨芐西林、頭孢拉定、阿奇霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萬古霉素、鏈霉素、恩諾沙星。

1.2.5 鏈球菌耐藥基因檢測(cè)：取1.5ML增菌液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取細(xì)菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。耐藥基因引物序列及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[4]，共檢測(cè)了10種鏈球菌耐藥基因（大環(huán)內(nèi)酯類：ermA；ermB；mefA；氨基糖苷類：Aph3’；四環(huán)素類：tetL；tetK；tetM；tetO；喹諾酮類：gyrA；ParC）。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鏈球菌的分離鑒定結(jié)果

于2020年接收該牛場(chǎng)的5次送樣共計(jì)52份樣品中分離出8株鏈球菌，編號(hào)為：1、5、7、13-1、6-2、4-2、20、23，基因測(cè)序鑒定顯示乳房鏈球菌4株（5、7、6-2、4-2）、停乳鏈球菌2株（20、23）、A群鏈球菌2株（1、13-1）。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，本次分離到的8株鏈球菌整體耐藥率不高，每株細(xì)菌均能篩選出3種以上的敏感藥物。從整體上看對(duì)鏈霉素、慶大霉素、諾氟沙星耐藥率最高，鏈霉素耐藥率100%；慶大霉素耐藥率87.5%，諾氟沙星耐藥率62.5%；對(duì)氨芐西林、頭孢拉定、萬古霉素耐耐藥率為0，對(duì)阿奇霉素、四環(huán)素耐藥率為37.5。具體結(jié)果見表1。

表1 鏈球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 （抑菌圈：mm）

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)分離的8株鏈球菌10種耐藥基因檢測(cè)顯示，大環(huán)內(nèi)酯類ermB基因和喹諾酮類的gyrA和ParC檢出率最高，其次是四環(huán)素類tetL，tetK基因；氨基糖苷類mefA，其他4種耐藥基因均未檢出。其中編號(hào)為13-1和6-2的A群鏈球菌攜帶耐藥基因最多，其次為編號(hào)20、23的停乳鏈球菌和編號(hào)1的乳房鏈球菌。攜帶耐藥基因最少的是編號(hào)為5、7、4-2的乳房鏈球菌。

表2 8株鏈球菌的耐藥情況統(tǒng)計(jì)

3 討論

本次試驗(yàn)主要分離到乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和A群鏈球菌，乳房鏈球菌分離率最高，并沒有分離到無乳鏈球菌，說明該場(chǎng)的常在乳房炎病原菌為乳房鏈球菌，與國內(nèi)的其他報(bào)道無相關(guān)性[5-7]，說明奶牛乳房炎病原微生物復(fù)雜多樣，不同牛場(chǎng)分離菌株存在差異性，并不能參照其他報(bào)道進(jìn)行預(yù)防與治療，所以檢測(cè)本場(chǎng)常在病原菌種類，明確病原菌的耐藥性顯得極其重要。

抗生素等抗菌藥仍是獸用抗炎藥物的主要選擇，在治療疾病方面起著重要的作用，無論是人類還是動(dòng)物，甚至植物在預(yù)防和治療各種細(xì)菌性感染疾病均離不開抗生素，然而對(duì)抗生素的過度依賴，加上濫用，對(duì)生命已經(jīng)造成了一些不可逆轉(zhuǎn)的危害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年抗生素總產(chǎn)量大約為21萬噸，國內(nèi)消費(fèi)量約18萬噸，其中用于畜牧及飼料行業(yè)的抗生素就高達(dá)9.7萬噸，約占54%[8]，由于抗生素的大量使用，我國已成為全世界耐藥性最嚴(yán)重的國家。在奶牛乳房炎的防治過程中大量依賴抗生素，也不同程度增加了細(xì)菌耐藥性，某些抗菌藥物幾乎沒有作用，給奶牛乳房炎的治療加大了難度。本試驗(yàn)中分離的8株細(xì)菌均有不同程度的耐藥，其中對(duì)鏈霉素已經(jīng)100%耐藥，慶大霉素和阿奇霉素的耐藥率也分別達(dá)87.5%和62.5%。因此建議該場(chǎng)需減少這幾類抗生素的使用，而選擇敏感性強(qiáng)的氨芐西林、頭孢拉定或者萬古霉素等相應(yīng)類抗生素。

在對(duì)8株鏈球菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，8株鏈球菌均不同程度的攜帶有耐藥基因，其中A群鏈球菌攜帶耐藥基因最多，其次是停乳鏈球菌和乳房鏈球菌。共計(jì)檢測(cè)出6種不同類型的耐藥基因，分別為gyrA（87.5%）、ParC（75.0%）、ermB（75.0%）、tetL（25.0%）、tetK（12.5%）、mefA（12.5%）?？梢钥闯霰敬畏蛛x出的鏈球菌攜帶喹諾酮類耐藥基因gyrA（87.5%）最高，其次是喹諾酮類耐藥基因ParC（75.0%）和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB（75.0%），氨基糖苷類耐藥基因Aph3’并未檢出，這與藥敏試驗(yàn)結(jié)果并沒有很高的符合率，藥敏試驗(yàn)中分離鏈球菌對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素和鏈霉素均有較強(qiáng)的抗藥性，也可能是攜帶了其他氨基糖苷類的耐藥基因所致。而喹諾酮類的耐藥基因除了編號(hào)4-1未檢出外，其他菌株均有攜帶，但對(duì)諾氟沙星的抗藥性卻為達(dá)到100%。說明細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，耐藥基因的檢測(cè)只能作為其中一環(huán)參考因素來考慮。

目前在治療奶牛乳房炎方面仍未研究出能完全替代抗生素的藥物，抗生素仍是治療奶牛乳房炎的首要選擇，因此如何合理的選則抗菌藥、完善抗菌藥的使用策略來減少細(xì)菌耐藥性德產(chǎn)生是臨床上亟待解決的問題，最簡(jiǎn)單的方式就是藥敏試驗(yàn)來篩選該養(yǎng)殖場(chǎng)常在致病菌的敏感藥物，避免過度使用無效抗生素。同時(shí)加大細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究，以期減少耐藥菌的產(chǎn)生。 □