薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能及TLR4-MyD88/TRIF信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用研究

黎 艷，王世棟，黃文川

（廣西南寧市第二人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，南寧 530031）

缺血性腦卒中是臨床常見(jiàn)的腦血管病變，其發(fā)病機(jī)制與年齡、性別等多種因素密切相關(guān)。臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙及神經(jīng)功能損傷，如不及時(shí)干預(yù)會(huì)導(dǎo)致疾病進(jìn)一步進(jìn)展惡化，給患者及其家人帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TLR4-MyD88/TRIF 信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致腦組織炎癥反應(yīng)增加，造成神經(jīng)損傷[2-3]。薯蕷皂苷元是從豆科和薯蕷科植物中提取分離得到的天然產(chǎn)物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，其對(duì)心腦血管疾病及腦缺血等疾病的治療具有顯著效果[4]，然而，薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中的治療作用及機(jī)制目前尚不十分清楚。本文通過(guò)研究薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中的改善作用及機(jī)制，為研究薯蕷皂苷元的藥理作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

薯蕷皂苷元（成都格利普生物科技有限公司，對(duì)照品，純度＞98%，批號(hào)20190921）；尼莫地平（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)1908051）；Toll樣受體-2（TLR-2）（上海信裕生物科技有限公司，貨號(hào)XYTLR2-Ra）；白介素（IL）-1β、IL-6 及腫瘤壞死因子（TNF-ɑ）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白測(cè)定試劑盒、蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)SEKR-0002、SEKR-0005、SEKR-0009、PC0020、G1120）；RNA 提取試劑盒、cDNA 提取試劑盒、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)KGA1202、KGA1316、KGA1028R）；TLR4、MyD88、TRIF 及GAPDH 兔多克隆抗體（賽默飛世爾科技有限公司；貨號(hào)48-2300、PA5-19919、PA5-106871、PA1-16777）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、RIPA組織裂解液、化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)A0208、P0013B、P0018M）；PCR 引物設(shè)計(jì)及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.2 設(shè)備與儀器

E-Gel Imager 凝膠成像儀（賽默飛世爾科技有限公司）；DB001Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司）；TGL-16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；IX83熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；YD-202石蠟切片機(jī)（上海文樂(lè)生物科技有限公司）；TB-FL1 石蠟包埋機(jī)（武漢天之瑞醫(yī)療科技有限公司）；ELx808酶標(biāo)儀（瑞士Lonza公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠72 只，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0014，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h/12 h明暗循環(huán)。

1.4 造模、分組及給藥

72 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（12只）及造模組（60只），參照文獻(xiàn)[5]的方法，采用四血管阻斷法建立缺血性腦卒中大鼠模型，具體方法：大鼠麻醉后于枕后位沿正中做一切口，在雙側(cè)第一橫突翼孔下通過(guò)椎動(dòng)脈熱凝4 s，24 h后沿頸部切開(kāi)，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈并使用動(dòng)脈夾夾閉，20 min后取下動(dòng)脈夾，逐層縫合傷口。以大鼠在造模后60 s 內(nèi)出現(xiàn)瞳孔放大、昏迷及翻正反射消失視為造模成功，假手術(shù)組大鼠只進(jìn)行傷口切開(kāi)及閉合，不進(jìn)行動(dòng)脈阻斷。造模成功后的大鼠隨機(jī)分為缺血性腦卒中模型組、薯蕷皂苷元低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組，每組12只。按照文獻(xiàn)[6]方法分別從運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)功能、平衡功能和反射功能對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，最低為0分，最高為18分，得分越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。薯蕷皂苷元低、中、高劑量組分別按照12.5 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg[7]的劑量灌胃給予大鼠薯蕷皂苷元，陽(yáng)性對(duì)照組按照20 mg/kg[8]的劑量灌胃給予大鼠尼莫地平，假手術(shù)組及缺血性腦卒中模型組灌胃給予大鼠生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥21 d[7]。末次給藥24 h后，再次對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

1.5 大鼠空間記憶能力測(cè)定

使用Morris 水迷宮測(cè)定大鼠空間記憶能力。將大鼠置于水迷宮，從水迷宮四個(gè)象限中點(diǎn)入水，待大鼠爬上逃逸平臺(tái)后將大鼠取出，連續(xù)訓(xùn)練4 d后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠從入水至首次爬上逃逸平臺(tái)的時(shí)間，記為逃避潛伏期，并記錄大鼠在90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)。

1.6 大鼠腦組織TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α測(cè)定

大鼠經(jīng)斷頭法處死后取腦組織，加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，研磨勻漿后，4 ℃，8 000 r/min離心15 min以獲得上清液。按照酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定腦組織TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α水平。

1.7 大鼠腦組織病理學(xué)檢查

大鼠斷頭法處死后分離腦組織，用石蠟包埋后切成5 μm切片，分別經(jīng)HE常規(guī)染色后，中性樹(shù)脂封片，在顯微鏡下進(jìn)行腦組織病理學(xué)檢查。

1.8 大鼠腦組織TLR4、MyD88 及TRIF mRNA 水平測(cè)定

斷頭法處死大鼠，分離腦組織，從腦組織中提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用RT-qPCR 試劑盒對(duì)TLR4、MyD88、TRIF 表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列

1.9 大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF蛋白測(cè)定

采用斷頭法處死大鼠后，取腦組織，使用4 ℃預(yù)冷的組織裂解液，加入蛋白酶抑制劑，研磨勻漿，4 °C 條件下，12 000 r/min，離心10 min，取上清液，采用BCA法定量測(cè)定總蛋白。取相當(dāng)于40 μg蛋白的勻漿液，經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，在室溫下封閉1.5 h，分別使用TLR4、MyD88、TRIF和GAPDH抗體（1∶3 000稀釋）在4°C下孵育過(guò)夜，使用TBST清洗5次，10 min/次，使用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1∶5 000 稀釋）孵育2 h，再次洗膜5次，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色后，在凝膠成像儀中成像，通過(guò)ImageJ1.8.0軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，缺血性腦卒中模型組、薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠給藥前神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯升高（均P＜0.05），缺血性腦卒中模型組、薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；給藥后，與缺血性腦卒中模型組比較，薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 給藥前、后各組間大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 ，n=12

表2 給藥前、后各組間大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 ，n=12

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血性腦卒中模型組比較，#P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比較，aP＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比較，bP＜0.05。

2.2 薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中大鼠空間記憶能力的影響

與假手術(shù)組比較，缺血性腦卒中模型組大鼠逃避潛伏期明顯增加（P＜0.05），90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與缺血性腦卒中模型組比較，薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠逃避潛伏期明顯降低（均P＜0.05），90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 大鼠逃避潛伏期及90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)比較 ，n=12

表3 大鼠逃避潛伏期及90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)比較 ，n=12

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血性腦卒中模型組比較，#P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比較，aP＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比較，bP＜0.05。

2.3 薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中大鼠腦組織TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α的影響

與假手術(shù)組比較，缺血性腦卒中模型組大鼠腦組織TLR-2、IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平均明顯升高（P＜0.05）；與缺血性腦卒中模型組比較，薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦組織TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 大鼠腦組織TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α比較結(jié)果 ，n=12

表4 大鼠腦組織TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α比較結(jié)果 ，n=12

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血性腦卒中模型組比較，#P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比較，aP＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比較，bP＜0.05。

2.4 薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中大鼠腦組織病理變化的影響

假手術(shù)組腦組織未見(jiàn)明顯病理改變，與假手術(shù)組比較，缺血性腦卒中模型組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，炎性浸潤(rùn)，細(xì)胞質(zhì)收縮，核仁明顯；與缺血性腦卒中模型組比較，薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦組織病理學(xué)改變明顯恢復(fù)，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腦組織病理改變比較（HE，×200）

2.5 薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF mRNA的影響

與假手術(shù)組比較，缺血性腦卒中模型組大鼠腦組織TLR4、MyD88 及TRIF mRNA 水平明顯升高（均P＜0.05）；與缺血性腦卒中模型組比較，薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF mRNA水平明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF mRNA水平比較 ，n=12

表5 大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF mRNA水平比較 ，n=12

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血性腦卒中模型組比較，#P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比較，aP＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比較，bP＜0.05。

2.6 薯蕷皂苷元對(duì)缺血性腦卒中大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF 蛋白的影響

與假手術(shù)組比較，缺血性腦卒中模型組大鼠腦組織TLR4、MyD88 及TRIF 蛋白水平明顯升高（均P＜0.05）；與缺血性腦卒中模型組比較，薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF 蛋白水平明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

研究表明，缺血性腦卒中并在臨床中呈現(xiàn)出發(fā)病率高、死亡率高及治愈率低等特點(diǎn)，主要采用藥物治療及外科手術(shù)治療等方式[9]，然而治療效果并不滿意，所以對(duì)于缺血性腦卒中的治療藥物的研發(fā)仍是目前的工作重點(diǎn)。尼莫地平是臨床中常用的一種腦血管調(diào)節(jié)劑，對(duì)于腦血管損傷及缺血性腦血管痙攣等具有顯著的改善作用[10]，因此本文采用尼莫地平作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

薯蕷皂苷元是主要存在于豆科和薯蕷科植物中的物質(zhì)，田友清等[11]發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元能夠通過(guò)降低血管壁一氧化氮水平，升高髓過(guò)氧化物酶水平等作用進(jìn)而發(fā)揮血管保護(hù)作用；寧可永等[12]報(bào)道了薯蕷皂苷元能夠降低心肌缺血大鼠丙二醛水平，并升高血管超氧化物歧化酶及一氧化氮水平，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用。由此可見(jiàn)，薯蕷皂苷元在血管性疾病的治療中可能具有較大潛力。

神經(jīng)功能缺損評(píng)分及空間定向能力是反映缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)損傷程度的重要指標(biāo)，神經(jīng)功能缺損評(píng)分及逃避潛伏期增加，90 s 內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)減少均提示神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能受損[13]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予大鼠不同劑量的薯蕷皂苷元后，大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、逃避潛伏期呈劑量依賴性逐漸降低，90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)逐漸增加，提示薯蕷皂苷元能夠呈劑量依賴性改善大鼠神經(jīng)功能，修復(fù)大鼠受損的運(yùn)動(dòng)功能。在缺血性腦卒中進(jìn)展過(guò)程中TLR4-MyD88/TRIF 通路被激活，導(dǎo)致TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-ɑ 等炎癥因子釋放增加，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞聚集，毛細(xì)血管通透性改變，腦組織出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)等病理改變[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與缺血性腦卒中模型組比較，薯蕷皂苷元各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦組織TLR-2、IL-1β、IL-6 及TNF-ɑ 水平呈劑量依賴性逐漸降低，提示薯蕷皂苷元能夠呈劑量依賴性降低腦組織炎癥細(xì)胞水平，抑制腦組織炎癥進(jìn)展，緩解腦組織炎癥浸潤(rùn)等病理性改變，進(jìn)而修復(fù)缺血性腦卒中引起的腦組織損傷。

TLR4-MyD88/TRIF 信號(hào)通路在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，李燦錐等[15]發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷大鼠腦組織細(xì)胞TLR4、MyD88 水平顯著升高，而抑制腦組織TLR4、MyD88水平則能夠明顯降低大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分及腦梗死體積，發(fā)揮對(duì)腦損傷的修復(fù)作用；祝美珍等[16]發(fā)現(xiàn)，腦缺血大鼠神經(jīng)損傷與腦組織TLR4、TRIF水平升高有關(guān)，使用清熱化瘀Ⅱ號(hào)方能夠通過(guò)抑制腦組織TLR4、TRIF 水平進(jìn)而緩解大鼠腦組織炎癥損傷，修復(fù)受損神經(jīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予大鼠薯蕷皂苷元后，大鼠腦組織TLR4、MyD88及TRIF mRNA及蛋白水平呈劑量依賴性的明顯降低，提示薯蕷皂苷元能夠呈劑量依賴性的抑制缺血性腦卒中大鼠腦組織TLR4-MyD88/TRIF 信號(hào)通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)損傷保護(hù)作用。

綜上所述，薯蕷皂苷元能夠修復(fù)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能及神經(jīng)損傷，抑制腦組織炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TLR4-MyD88/TRIF 信號(hào)通路有關(guān)。