異甘草酸鎂對酒精性肝病大鼠肝組織Nrf2/HO-1信號通路和肝纖維化指標(biāo)的影響*

張 曼，張曉偉，徐圣秋，郭洪梅

（徐州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，徐州 221000）

酒精性肝病（ALD）是長期大量飲酒引發(fā)的慢性肝病，隨著我國生活水平的提高，ALD 的發(fā)病率也逐年升高[1]。ALD 是一種進(jìn)行性疾病，病變過程為脂肪變性、脂肪型肝炎、纖維化，最后不可逆進(jìn)展為肝硬化，嚴(yán)重威脅國民的健康與安全[2]。異甘草酸鎂（MgIG）是一種肝細(xì)胞胞保護(hù)劑，具有抗炎、抗纖維化、改善肝功能等作用，臨床應(yīng)用MgIG 治療ALD療效顯著，且不良反應(yīng)較少[3-4]。但MgIG在ALD中的具體作用機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)階段，ALD的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激在ALD 發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位[5]。核因子2 相關(guān)因子/血紅素氧合酶（Nrf2/HO-1）信號通路是維持氧化還原平衡的重要途徑，其在ALD發(fā)生發(fā)展中有關(guān)鍵作用[6]。本研究將從Nrf2/HO-1 通路的角度，分析MgIG 在ALD 大鼠中的保護(hù)作用，旨在為MgIG 治療ALD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠，雄性，SPF 級別，6～8 周，體質(zhì)量180～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物使用許可證號SCXK（京）2020-0035。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房中，室內(nèi)溫度為20～24 ℃，相對濕度為50%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2 藥品與主要試劑

MgIG 注射液（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20051942，規(guī)格：10 mL：50 mg×2支），丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBil）、甘油三酯（TG）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）生化試劑盒（南京建成生物科技有限公司），層黏蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）和Ⅲ型前膠原肽（PC-Ⅲ）ELISA 試劑盒（美國Biosource），Nrf2、HO-1引物序列由北京閱微基因技術(shù)有限公司提供，Nrf2、HO-1 蛋白一抗（美國Abcam）。

1.3 分組、建模及干預(yù)

將50 只SD 大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及MgIG低、中、高劑量組，每組10 只。除對照組外，其他組大鼠給予Liber-DeCarli 酒精液體飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)6 周后觀察肝脂肪變性程度及肝細(xì)胞形態(tài)變化情況，檢驗ALD大鼠模型制備情況[6]，對照組以普通飼料喂養(yǎng)。模型大鼠制備成功后，MgIG 低、中、高劑量組分別腹腔注射15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg MgIG，1 次/d，連續(xù)注射8 周，對照組和模型組注射等體積生理鹽水。

1.4 動物處理

給藥結(jié)束后，眼眶取血分離血清，置于-20 ℃冰箱凍存，快速取出肝組織，部分固定于多聚甲醛進(jìn)行病理觀察，剩余組織置于液氮罐保存。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 肝功能、氧化應(yīng)激指標(biāo)及肝組織TG 含量的檢測 采用生化試劑盒檢測血清ALT、AST、TBil、SOD、MDA、GSH 和肝組織TG 含量，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀下檢測各孔吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度。

1.5.2 病理切片觀察 取新鮮肝組織固定于中性多聚甲醛溶液中過夜，制備肝組織石蠟切片（厚度為4 μm），行常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）、Masson染色，顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理變化和纖維化程度。

1.5.3 纖維化指標(biāo)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測肝組織LN、HA和PC-Ⅲ水平，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀下檢測各孔吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度。

1.5.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測肝組織中Nrf2、HO-1 mRNA 水平 取肝組織樣品添加Trizol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再混合SYBR Green MasterMix進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，程序設(shè)置為95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃15 s，72 ℃35 s，總40個循環(huán)。Nrf2上游引物為5’-CTCGCTGGAAAAAGAAGTG-3’，下游為5’-CCGTCCAGGAGTTCAGAGG-3’；HO-1 上游引物為5’-CGTCACTTCGTCAGAGGCCTGC-3’，下游為5’-TCTGGGGTTTCCCTCGGGGTG-3’。采用2-△△CT公式，以GAPDH為內(nèi)參，計算Nrf2、HO-1 mRNA 的相對表達(dá)水平。

1.5.5 蛋白印跡法（Western blotting）檢測肝組織中Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá) 取肝組織樣品添加裂解液提取蛋白，測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫下孵育1 h，封閉PVDF膜上的非特異性位點，再分別加入Nrf2、HO-1、β-actin 蛋白一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔/鼠蛋白二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h，抗體結(jié)合免疫結(jié)束后添加化學(xué)發(fā)光試劑，進(jìn)行顯影成像，以β-actin 為內(nèi)參，目的條帶與β-actin 條帶灰度值比值反映Nrf2、HO-1的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能和TG含量的比較

模型組血清ALT、AST、TBil 及肝組織TG 含量均明顯高于對照組（均P＜0.05）；與模型組比較，MgIG 中、高劑量組ALT、AST、TBil 及TG 水平明顯降低（均P＜0.05），且MgIG 中、高劑量組ALT、AST、TBil 水平低于MgIG 低劑量組，MgIG 高劑量組TG水平低于MgIG低劑量組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠肝功能和TG含量的比較 ，n=10

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與MgIG低劑量組比較，△P＜0.05。

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)觀察的結(jié)果

HE 染色顯示，相較于對照組，模型組肝組織細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重，匯管區(qū)伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤，小葉內(nèi)出現(xiàn)不同程度的壞死；MgIG 處理后，肝組織病理損傷減輕，其中MgIG 高劑量組效果最佳。Masson 染色顯示，相較于對照組，模型組終末靜脈增厚，膠原纖維向竇周隙延伸，匯管區(qū)及周圍纖維化明顯；MgIG處理后纖維化程度明顯減輕，以MgIG高劑量組改善明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)觀察圖

2.3 各組大鼠肝組織纖維化指標(biāo)的比較

模型組肝組織LN、HA 和PC-Ⅲ含量明顯高于對照組（P＜0.05）；與模型組比較，MgIG 中、高劑量組LN、HA 和PC-Ⅲ含量明顯降低（均P＜0.05），且MgIG 高劑量組LN、HA 水平低于MgIG 中、低劑量組，MgIG 中劑量組LN、HA 水平低于MgIG 低劑量組，MgIG中、高劑量組PC-Ⅲ水平低于MgIG低劑量組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠肝組織纖維化指標(biāo)的比較 ，n=10

表2 各組大鼠肝組織纖維化指標(biāo)的比較 ，n=10

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與MgIG 低劑量組比較，△P＜0.05；與MgIG 中劑量組比較，▲P＜0.05。

2.4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

模型組血清SOD、GSH 水平明顯低于對照組，MDA 水平明顯高于對照組（P＜0.05）；與模型組比較，MgIG 中、高劑量組SOD、GSH 水平明顯升高，MDA水平明顯降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表3。

表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 ，n=10

表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 ，n=10

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與MgIG 低劑量組比較，△P＜0.05；與MgIG 中劑量組比較，▲P＜0.05。

2.5 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1表達(dá)的比較

模型組肝組織Nrf2、HO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)高于對照組（P＜0.05）；與模型組比較，MgIG 中、高劑量組Nrf2、HO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），且MgIG高劑量組Nrf2 mRNA水平高于MgIG劑量組，MgIG中、高劑量組HO-1 mRNA水平高于MgIG 劑量組（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表4、圖2。

表4 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1表達(dá)的比較 ，n=10

表4 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1表達(dá)的比較 ，n=10

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與MgIG 低劑量組比較，△P＜0.05；與MgIG中劑量組比較，▲P＜0.05。

圖2 大鼠肝組織中Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究通過喂食酒精液體飼料構(gòu)建ALD模型，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠ALT、AST、TBil 及肝組織TG 含量明顯升高，且肝組織病理切片也呈現(xiàn)出典型的肝病特征，表明ALD大鼠模型構(gòu)建成功。ALT、AST、TBil 是肝臟內(nèi)重要的功能酶系，是肝功能評價的敏感指標(biāo)[7]。正常情況下，ALT、AST、TBil 在血清中含量較低，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，肝細(xì)胞膜通透性增加，ALT、AST、TBil 將由細(xì)胞質(zhì)釋放進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致血清水平升高[8]。通過觀察大鼠肝功能變化情況：MgIG 處理后，大鼠ALT、AST、TBil水平較模型組降低（P＜0.05），表明MgIG可改善ALD大鼠肝功能，這與MgIG的臨床應(yīng)用效果相符[9]。長期酒精代謝造成肝細(xì)胞損傷，會引起肝臟血脂代謝異常，表現(xiàn)出脂肪樣變性，導(dǎo)致TG水平升高[10]。本實驗中MgIG 各劑量結(jié)果表明，MgIG可通過降低肝組織中TG 含量，且肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，MgIG組和模型組相比，肝細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)均得到明顯改善，進(jìn)一步說明MgIG 具有保肝作用。

人體攝入的酒精大部分均在肝臟中代謝，這個過程中會產(chǎn)生大量的活性氧，引發(fā)脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)，生成具有細(xì)胞毒性的終產(chǎn)物MDA，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[11]。正常生理狀態(tài)下，Nrf2處于非活化狀態(tài)，并作為目標(biāo)被蛋白體酶降解，當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激時，Nrf2將被激活進(jìn)入細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合，激活下游靶基因HO-1、SOD 等代謝酶，發(fā)揮抗氧化作用[12]。GSH 也是體內(nèi)重要的抗氧化劑，可清除氧自由基[13]。Yang等[14]研究顯示，MgIG可通過抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX1）、NOX2和NOX4的表達(dá)，減少活性氧的產(chǎn)生，從而預(yù)防果糖誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激損傷。本實驗中，模型組抗氧化酶SOD 和GSH 活力下降，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA水平升高（P＜0.05），表明ALD大鼠肝損傷與氧化/抗氧化水平失衡有關(guān)。干預(yù)MgIG 后，SOD 和GSH 水平上升，體內(nèi)抗氧化能力明顯增強(qiáng)，MDA 水平減少，有效阻滯過度的脂質(zhì)過氧化。同時，RT-qPCR和Western blotting結(jié)果顯示，與模型組比較，MgIG 組肝組織Nrf2、HO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），提示MgIG 可能通過調(diào)控Nrf2/HO-1 信號通路，從而減輕ALD 大鼠的氧化應(yīng)激。

ALD的治療中延緩肝纖維化的進(jìn)程、最大程度預(yù)防肝硬化，有重要的臨床意義。肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，是肝纖維化發(fā)生的主要機(jī)制[15]。肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的成分以Ⅰ型和Ⅲ型膠原為主，LN 是肝細(xì)胞外基質(zhì)中特有的非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白，HA主要有星狀細(xì)胞合成，可與膠原結(jié)構(gòu)蛋白、蛋白多糖等構(gòu)成結(jié)締組織，PC-Ⅲ是肝內(nèi)膠原蛋白增加的主要成分[16]。Sui 等[17]通過四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，發(fā)現(xiàn)MgIG 可抑制肝星狀細(xì)胞的活化，從而發(fā)揮抗纖維化作用。纖維化參數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，MgIG 組大鼠肝組織LN、HA和PC-Ⅲ含量明顯低于模型組（P＜0.05），表明MgIG 在ALD 中可能通過改善肝組織纖維化，以保護(hù)肝損傷。

綜上所述，MgIG 能夠改善ALD 大鼠肝組織的病理學(xué)改變，改善肝功能，降低TG 含量，可能通過Nrf2/HO-1 途徑減輕氧化應(yīng)激及改善肝纖維化，從而緩解酒精性肝損傷。