LPAR1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制研究*

呂俊杰，鐘彩琴，張振宇，劉 朋，姚 鵬

（遼寧錦州市中心醫(yī)院 1.骨科；2.神經(jīng)內(nèi)科，錦州 121000；3.遼寧錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，錦州 121000）

骨肉瘤是由間質(zhì)細(xì)胞系發(fā)展而來(lái)，由于其常伴有較高的轉(zhuǎn)移傾向性，患者的預(yù)后情況往往不如人意，病死率居高不下，對(duì)骨肉瘤的復(fù)發(fā)、死亡率的控制仍然是目前臨床醫(yī)學(xué)工作中的一個(gè)重難點(diǎn)[1]。因此，研究骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于探尋更為有效的防治手段、降低病死率及預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有十分重要的意義。近些年的研究顯示，溶血磷脂酸受體-1（recombinant lysophosphatidic acid receptor 1，LPAR1）可通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路來(lái)參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等過(guò)程，與包括結(jié)腸癌[2]、卵巢癌[3]、前列腺癌[4]等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程關(guān)系密切。然而，目前有關(guān)LPAR1 對(duì)骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的影響及作用機(jī)制的研究尚不多見(jiàn)?；诖?，本研究討探了LPAR1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機(jī)制，以期為臨床抗骨肉瘤治療的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性BALB/c裸小鼠20只，4～6周齡，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)[許可證號(hào)：SCXK（遼）2019-0003]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 人骨肉瘤細(xì)胞株MG63、U2OS 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海）生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。LPAR1表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自博邁德公司。

10%FBS、DEME 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Trizol試劑、Lipofectamine?2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Transwell小室及細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)BD 公司；Bradford 蛋白定量試劑、Gimsa 染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bender 公司；LPAR1、Ki67、CDK2、CCNB1、BCL2、BAX、pmTOR、mTOR、pAKT、AKT 及β-actin 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司或美國(guó)Abgent 公司，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG（ZB2301）購(gòu)自北京中杉金橋公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 生物信息學(xué)分析 GEO2R 分析骨肉瘤3 個(gè)相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE33382、GSE16088、GSE14359 中LPAR1 的表達(dá)水平。下載TCGA 骨肉瘤數(shù)據(jù)，以骨肉瘤中LPAR1表達(dá)水平的四分位數(shù)分組，將骨肉瘤患者分為L(zhǎng)PAR1高（上四分之三）/低（下四分之一）兩組，采用GSEA 4.0 軟件分析LPAR1 表達(dá)水平與細(xì)胞惡性表型的關(guān)系。本研究按照默認(rèn)參數(shù)設(shè)置進(jìn)行富集分析，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS 培養(yǎng)于含10%滅活FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每2～3 d 換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LPAR1細(xì)胞系在細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)完成轉(zhuǎn)染。其中以過(guò)表達(dá)LPAR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組記作LPAR1組，空載轉(zhuǎn)染作為空載體組。隨后用G418篩選并構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LPAR1 的MG63、U2OS 細(xì)胞系。Western blotting 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞中的LPAR1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 取各組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔接種3 000個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，于規(guī)定時(shí)間加入稀釋后的CCK-8 試劑進(jìn)行檢測(cè)，采用DNM-9606酶標(biāo)分析儀（北京朗普新技術(shù)有限公司，中國(guó)）檢測(cè)各孔在450 nm 處的OD 值，此后每天檢測(cè)1 次OD值，連續(xù)檢測(cè)5 d，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將37 ℃預(yù)溫培養(yǎng)液10 mL 加入到培養(yǎng)皿中，取各組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，于6 孔板中每孔接種500 個(gè)細(xì)胞。十字輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻后，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)靜置培養(yǎng)。肉眼觀察到培養(yǎng)皿中出現(xiàn)可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清，PBS洗滌，加入醋酸/甲醇（1∶3）溶液固定15 min，Gimsa 染色液染色20 min，流水緩慢清洗，空氣干燥。計(jì)數(shù)肉眼可見(jiàn)的克隆數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 取各組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整為1×106個(gè)/mL后在6 孔板中接種，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48 h 后收集各組細(xì)胞到離心管中，1 000 r/min離心5 min，PBS 洗滌，棄去上清，PI 染色，4 ℃避光孵育30 min。采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD 公司，美國(guó)）進(jìn)行上樣檢測(cè)，計(jì)數(shù)2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，使用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析結(jié)果。對(duì)于細(xì)胞凋亡，則根據(jù)Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色后上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.9 Transwell 小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)在Transwell 小室中進(jìn)行。行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，先取Matrigel 稀釋液并用移液器均勻涂抹在小室底部，待其均勻凝固。取各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，于小室內(nèi)每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。24 h 后取出小室，PBS 洗滌，10%中性甲醛溶液固定，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍（×100）視野，統(tǒng)計(jì)過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.10 Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后的總蛋白，Bradford 調(diào)節(jié)蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，密封2 h，分別添加LPAR1、Ki67、CDK2、CCNB1、BCL2、BAX、pmTOR、mTOR、pAKT、AKT 及β-actin一抗（1∶400），4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000）繼續(xù)孵育1 h，TBST 漂洗，ECL 發(fā)光液顯色，暗室曝光。

1.11 裸鼠分組及體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 將18 只裸鼠隨機(jī)分為2 組，每組9 只。于裸鼠右腋下分別注射穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LPAR1和空載對(duì)照的MG63細(xì)胞，每組注射5×106個(gè)細(xì)胞。飼養(yǎng)期間動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，每2 d 用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤的最大長(zhǎng)徑（a）、橫徑（b），腫瘤體積計(jì)算公式：V=1/2ab2，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。飼養(yǎng)14 d后將所有裸鼠處死，取出皮下腫塊并記錄體積、質(zhì)量。

1.12 免疫組化法檢測(cè)LPAR1 在瘤體組織中表達(dá)情況 取各組小鼠瘤體組織標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，常規(guī)制成3 μm 切片。參考SP 免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍（×400）視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性著色細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。LPAR1以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 與SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在GSEA 中，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25 的基因集為顯著富集基因集。

2 結(jié)果

2.1 LPAR1的功能基因集富集

利用GEO2R 分析骨肉瘤3 個(gè)數(shù)據(jù)集中的差異基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPAR1 在骨肉瘤中低表達(dá)，見(jiàn)圖1A。經(jīng)GSEA分析，結(jié)果顯示，負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖、負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡基因集及負(fù)調(diào)控細(xì)胞遷移、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移的基因集富集在LPAR1高表達(dá)組，見(jiàn)圖1B～G。

圖1 LPAR1在骨肉瘤中的表達(dá)水平且與細(xì)胞惡性表型的關(guān)系

2.2 LPAR1對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響

Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPAR1 組的人骨肉瘤細(xì)胞系MG63、U2OS 的LPAR1 的蛋白明顯高于空載組（P＜0.05），提示成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LPAR1 的人骨肉瘤細(xì)胞系MG63、U2OS，見(jiàn)圖2A。與空載體組相比，LPAR1 組人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS 的細(xì)胞活力、克隆形成率均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2B～C。與空載體組相比，LPAR1組人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS處于G0/G1期的比例明顯上升，處于S期的比例明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯上升，細(xì)胞Ki67、CDK2、CCNB1、BCL2 蛋白表達(dá)明顯下降，BAX蛋白表達(dá)明顯上升（均P＜0.05），見(jiàn)圖2E～G。

圖2 LPAR1對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響

2.3 LPAR1 對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell小室結(jié)果顯示，與空載體組相比，LPAR1組人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS的細(xì)胞遷移和侵襲能力均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 LPAR1對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

2.4 LPAR1對(duì)裸鼠成瘤的影響

與空載體組相比，LPAR1 組裸鼠的瘤體體積、質(zhì)量明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4A～D。與空載體組相比，LPAR1組小鼠瘤體組織中的LPAR1蛋白表達(dá)水平明顯上升（P＜0.05），見(jiàn)圖4E。

圖4 LPAR1對(duì)裸鼠成瘤的影響

2.5 LPAR1對(duì)AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空載體組相比，LPAR1 組人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS 中pmTOR/mTOR、pAKT/AKT 表達(dá)明顯下降，見(jiàn)圖5。

圖5 LPAR1對(duì)AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）作為一種細(xì)胞間磷脂類(lèi)信號(hào)分子，因其能夠在細(xì)胞的多種生理功能中發(fā)揮效應(yīng)而逐漸受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[5]。研究顯示，其能夠通過(guò)G蛋白耦聯(lián)受體（Gprotein-coupled receptors，GPRs），來(lái)引發(fā)生長(zhǎng)激素樣作用，進(jìn)而對(duì)生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、血小板聚集等多種過(guò)程造成影響，并在各種病理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色[6-7]。LPAR1是GPRs之一，能與LPA結(jié)合，有證據(jù)表明，LPAR1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲性生長(zhǎng)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但其確切作用機(jī)制仍在探討中[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，主要分析LPAR1 在骨肉瘤中的表達(dá)情況及其對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS 增殖、遷移和侵襲能力的影響，并嘗試探討可能的作用機(jī)制。

目前，有關(guān)LPAR1 對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響尚未有定論。Fukushima 等[9]研究報(bào)道，過(guò)表達(dá)LPAR1對(duì)胰腺癌細(xì)胞的侵襲活性具有促進(jìn)作用，而Ma等[10]研究則指出，LPAR1在胃癌組織中顯著下調(diào)，且LPAR1下調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和遷移。本研究基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LPAR1在骨肉瘤中低表達(dá)，且GSEA分析結(jié)果顯示，與負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖、負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期、負(fù)調(diào)控細(xì)胞侵襲及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)的基因集均明顯富集在LPAR1高表達(dá)組，提示LPAR1能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，并促進(jìn)凋亡。

同時(shí)，本研究選擇人骨肉瘤細(xì)胞MG63 和U2OS細(xì)胞系為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LPAR1的細(xì)胞系來(lái)分析LPAR1對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載體組相比，LPAR1 組的細(xì)胞活力、克隆形成率均出現(xiàn)明顯下降；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果亦表明過(guò)表達(dá)LPAR1能夠阻滯細(xì)胞進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Ki-67是常見(jiàn)的調(diào)控細(xì)胞增殖的蛋白之一，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)關(guān)系[11-12]；BCL2則是在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，能抑制細(xì)胞凋亡[13]。CDK2、CCNB1是常見(jiàn)的兩種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白：CDK2對(duì)細(xì)胞從G1期過(guò)渡到S期十分重要；CCNB1則能與CDKs結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞的G2/M 期轉(zhuǎn)變[14]。本研究Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載體組相比，LPAR1 組中上述細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)明顯失調(diào)，與CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果相符，進(jìn)一步表明過(guò)表達(dá)LPAR1 對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS 的增殖活性具有抑制作用，提示LPAR1在骨肉瘤細(xì)胞中具有抗腫瘤細(xì)胞增殖的特性。Transwell小室結(jié)果顯示，與空載體組相比，LPAR1組細(xì)胞遷移和侵襲能力均出現(xiàn)明顯下降，提示過(guò)表達(dá)LPAR1對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲具有抑制作用。

在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究還進(jìn)行了裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑制，其成瘤體積、質(zhì)量均明顯下降；同時(shí)，采用免疫組化法觀察到LPAR1 組小鼠瘤體組織中LPAR1 蛋白表達(dá)明顯高于空載體組，提示LPAR1 確實(shí)在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用；表明過(guò)表達(dá)LPAR1能夠抑制裸鼠成瘤。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種特定的信號(hào)傳遞通路在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵效用。其中，Akt/mTOR 信號(hào)通路參與調(diào)控包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、粘附、腫瘤血管生成等過(guò)程[15]。本研究觀察人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS中Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與空載體組相比，LPAR1 組人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS 中pmTOR、pAKT 蛋白表達(dá)明顯下降，提示過(guò)表達(dá)LPAR1能通過(guò)去磷酸化抑制Akt/mTOR信號(hào)通路，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力下降的重要機(jī)制之一。

綜上所述，LPAR1 在骨肉瘤中低表達(dá)，且過(guò)表達(dá)LPAR1 能夠抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS 的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)凋亡，抑制裸鼠成瘤，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。