下調(diào)整合素β1對大腸癌細胞的西妥昔單抗化療敏感性的影響及機制研究*

張壯苗，鄧黎黎，張 巖，馬麗輝

（海南三亞市人民醫(yī)院腫瘤血液科，三亞 572000）

大腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國大腸癌的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平，嚴重威脅著人民身體健康。當前大腸癌治療首選外科手術(shù)，藥物化療是術(shù)前、術(shù)后重要的輔助治療手段[1-2]。西妥昔單抗是一種針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的嵌合單克隆抗體，屬于治療轉(zhuǎn)移性大腸癌的一線化療藥物，對大腸癌有確切的抑制作用。但化療過程中，腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生的抵抗能力使得西妥昔單抗的臨床治療效果大大降低，而難以徹底清除的腫瘤細胞引起腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，是導致大腸癌治療失敗和患者死亡的主要原因[3]。因此，如何提高大腸癌化療敏感性一直是臨床研究重點和熱點。

整合素β1（integrin β1，ITGB1）是一種重要的黏附分子，在惡性腫瘤的進展中起重要作用，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。既往研究表明，大腸癌中ITGB1 表達上調(diào)，ITGB1 高表達與大腸癌患者整體生存時間短等不良預(yù)后有關(guān)，可作為潛在預(yù)后預(yù)測因子[5]。也有研究表明ITGB1 在乳腺癌、鼻咽癌等癌細胞產(chǎn)生化療耐藥性中起著重要作用，靶向ITGB1可以提高紫杉醇、吉西他濱等化療藥物的敏感性[6-8]。但目前關(guān)于ITGB1 在大腸癌治療過程中改善藥物化療敏感性的研究較少，ITGB1 對西妥昔單抗敏感性的作用效果及分子機制尚不完全清楚。因此，本研究探討ITGB1表達變化對西妥昔單抗抗大腸癌化療敏感性的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 患者和組織樣本收集 收集在海南三亞市人民醫(yī)院行手術(shù)切除且經(jīng)病理檢查確診的56 例原發(fā)性大腸癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織。排除合并其他系統(tǒng)性腫瘤或腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移者，排除術(shù)前接收化療或放療的患者。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，批準文號為：2020-1-143。所有患者均自愿簽署知情同意書。

1.2 主要材料與試劑 人大腸癌LS174T 細胞（美國ATCC 細胞庫）；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素與青霉素（武漢普諾賽生命科技有限公司）；西妥昔單抗（100 mg/20 mL/瓶）（德國默克里昂制藥公司）；特異性干擾ITGB1 表達的siRNA 和無干擾作用的siRNA（上海吉凱基因科技有限公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；CCK-8試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒、二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、細胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）；SYBR Premix Ex Taq 熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takala公司）；兔源Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc抗體，鼠源β-actin、GAPDH抗體，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗（美國Abcam 公司）；PVDF 膜、ECL試劑（美國Millipore公司）。

1.3 細胞培養(yǎng) 將大腸癌LS174T 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期細胞開展實驗。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期LS174T 細胞，以1×105個/孔接種于24孔板，細胞培養(yǎng)24 h后，隨機分為5 組：空白對照組（正常培養(yǎng)）、NC-siRNA組（轉(zhuǎn)染無干擾作用的siRNA）、ITGB1-siRNA 組（轉(zhuǎn)染特異性干擾ITGB1 表達的siRNA）、西妥昔單抗組（終濃度為50 μg/mL的西妥昔單抗干預(yù)24 h）、ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組（轉(zhuǎn)染特異性干擾ITGB1表達的siRNA，同時用終濃度為50 μg/mL的西妥昔單抗干預(yù)24 h）。轉(zhuǎn)染操作嚴格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。各組轉(zhuǎn)染細胞于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測ITGB1 mRNA 表達水平 用Trizol 法提取大腸癌組織、癌旁組織及各組細胞總RNA，應(yīng)用酶標儀測定RNA純度和濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成互補鏈cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR 試劑盒進行RT-qPCR 反應(yīng)。引物序列如下：ITGB1 上游引物：5’-ATGTGTCAGACCTGCCTTGG-3’，下游：5’-GCTGGGGTAATTTGTCCCGA-3’；GAPDH 上游引物：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT3’，下游：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。反應(yīng)體系（20 μL）：10 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL，cDNA 模板2 μL，SYBR Premix Ex Taq 11.5 μL，ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃60 s，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s，重復40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次。

1.6 CCK-8法檢測LS174T細胞增殖活性 將各組細胞按照1×105/mL 的濃度接種于96 孔板，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔設(shè)置5個復孔，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，混勻后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱孵育4 h，采用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（OD）值，以O(shè)D值反映細胞增殖活力。實驗重復3次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測LS174T細胞周期分布情況收集各組細胞，3 000 r/min 離心10 min 收集沉淀細胞，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次后，加入預(yù)冷的75%乙醇固定，置于4 ℃冰箱過夜，再次離心收集細胞，PBS 沖洗2 次后，加入50 μL 水解酶RNase A，37 ℃水浴1 h，加入200 μL PI 染液避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期分布。實驗重復3次。

1.8 流式細胞術(shù)檢測LS174T細胞凋亡情況 收集各組細胞，調(diào)整細胞密度為2×104/mL，按200 μL/孔接種于6 孔板，每組設(shè)置5 個復孔，培養(yǎng)過夜，收集細胞，3 000 r/min離心10 min收集沉淀，用預(yù)冷PBS洗滌2遍，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC溶液和5 μL PI溶液，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測分析各組細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.9 Western blotting 法檢測LS174T 細胞凋亡相關(guān)蛋白及Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白表達水平

收集各組細胞，用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液在冰上裂解30 min提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE 電泳分離，將分離的蛋白濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下在含5%脫脂牛奶的TBST 緩沖液中封閉1 h，TBST 緩沖液洗滌3 次×10 min，分別加入兔源Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc 一抗（1∶1 000）和鼠源β-actin、GAPDH 一抗（1∶1 000）在4 ℃冰箱孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次×10 min，加入相應(yīng)HRP標記的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（1:5 000）在室溫下孵育1 h。采用ECL 試劑顯影，分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ITGB1 在大腸癌組織中表達水平 大腸癌組織中ITGB1 mRNA 相對表達量顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 ITGB1在大腸癌組織中表達水平

2.2 轉(zhuǎn)染后LS174T 細胞ITGB1 mRNA 表達水平比較 轉(zhuǎn)染48 h 后，NC-siRNA 組和西妥昔單抗組LS174T細胞ITGB1 mRNA相對表達量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；ITGB1-siRNA組和ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組LS174T細胞ITGB1 mRNA 相對表達量均顯著低于空白對照組（P＜0.05）；ITGB1-siRNA 組和ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組LS174T細胞ITGB1 mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后LS174T細胞ITGB1 mRNA表達水平比較

2.3 ITGB1 表達下調(diào)對西妥昔單抗抑制大腸癌細胞增殖活性的作用 NC-siRNA組細胞增殖活性與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組細胞增殖活性顯著低于空白對照組（P＜0.05）；ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組細胞增殖活性顯著低于ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組（P＜0.05），見圖3。

圖3 ITGB1 表達下調(diào)對西妥昔單抗抑制大腸癌細胞增殖活性的作用

2.4 ITGB1 表達下調(diào)對西妥昔單抗阻滯大腸癌細胞G2/M周期的作用 與空白對照組比較，NC-siRNA組細胞周期分布無明顯差異（P＞0.05），ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組細胞阻滯于G2/M 期，該期細胞數(shù)量顯著升高（P＜0.05），S期細胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05），G0/1 期細胞數(shù)量無明顯變化（P＞0.05）。ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組G2/M 期細胞數(shù)量顯著高于ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組（P＜0.05），S期細胞數(shù)量顯著低于ITGB1-siRNA組和西妥昔單抗組（P＜0.05），G0/1 期細胞數(shù)量無明顯變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 ITGB1表達下調(diào)對西妥昔單抗阻滯大腸癌細胞G2/M周期的作用

2.5 ITGB1 表達下調(diào)對西妥昔單抗促進大腸癌細胞凋亡的作用 與空白對照組比較，NC-siRNA 組細胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達量顯著升高，Bcl-2 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組細胞凋亡率、Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達量均顯著高于ITGB1-siRNA組和西妥昔單抗組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達量顯著低于ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組（P＜0.05），見圖5。

圖5 ITGB1表達下調(diào)對西妥昔單抗促進大腸癌細胞凋亡的作用

2.6 ITGB1 表達下調(diào)對西妥昔單抗調(diào)控大腸癌細胞Hedgehog 信號通路相關(guān)蛋白表達的作用 與空白對照組比較，NC-siRNA 組SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc 蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc蛋白表達量均顯著低于ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組（P＜0.05），見圖6。

圖6 ITGB1表達下調(diào)對西妥昔單抗調(diào)控大腸癌細胞Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白表達的作用

3 討論

大腸癌在我國發(fā)生風險較高，且大部分患者在確診時腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移，導致治療難度增加，患者預(yù)后差[9]。目前大腸癌的治療以手術(shù)和化療為主，西妥昔單抗是大腸癌的常用化療藥物，以西妥昔單抗為主的聯(lián)合化療或綜合治療也是大腸癌治療的臨床常用方案。西妥昔單抗是一種靶向分子藥物，主要通過與EGFR 的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻斷細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的激活，調(diào)控腫瘤細胞增殖和凋亡；該藥還可競爭性阻斷EGFR 與其配體的相互作用，阻斷EGFR 下游信號轉(zhuǎn)導通路，進而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[10-11]。但當化療藥物使用次數(shù)增多或作用時間過長時，腫瘤細胞會產(chǎn)生耐藥性，致使西妥昔單抗等化療藥物達不到預(yù)期效果。因此深入研究大腸癌耐藥的相關(guān)分子機制是提高西妥昔單抗等藥物化療敏感性的主要途徑之一。

大量研究證實，整合素在腫瘤進展及耐藥性產(chǎn)生中的作用受到廣泛關(guān)注，其中ITGB1在多種惡性腫瘤中高表達并促進腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移[12-13]。在肝癌、腎癌中，ITGB1 通過調(diào)控ROCK1、Mcl-1 等表達促進細胞增殖、遷移和侵襲[14-15]，而在食管鱗癌和乳腺癌中，ITGB1 是腫瘤耐藥的重要效應(yīng)因子[16-17]。本研究結(jié)果顯示，ITGB1 在大腸癌組織中高表達，ITGB1 表達下調(diào)顯著增強西妥昔單抗抑制大腸癌細胞增殖、阻滯細胞G2/M 周期及誘導細胞凋亡的作用（P＜0.05）。此外，本研究結(jié)果顯示，下調(diào)ITGB1表達并給予西妥昔單抗干預(yù)后，大腸癌細胞中促凋亡蛋白Cleaved caspase-3 和Bax 表達顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調(diào)（P＜0.05），表明ITGB1 表達下調(diào)能夠顯著增強西妥昔單抗調(diào)控大腸癌細胞凋亡蛋白表達的作用，提示ITGB1表達下調(diào)可增強大腸癌細胞對西妥昔單抗的化療敏感性。

Hedgehog 信號通路在人體發(fā)育和各種生理過程中起著重要調(diào)控作用，多數(shù)情況下該信號通路處于高度抑制狀態(tài)，一旦發(fā)生失調(diào)則容易引發(fā)腫瘤。Hedgehog通路中信號傳導取決于SHh蛋白的表達，低SHh信號條件下，SHh與Ptch1結(jié)合減少，Gli活性發(fā)生改變，出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能，而在高SHh信號條件下，SHh 與Ptch1 結(jié)合，Gli 保持原有活性，行使轉(zhuǎn)錄激活功能，激活的Hedgehog通路介導下游多種生長因子表達，引起細胞分裂和修復受損DNA的原癌基因c-Myc 表達水平上調(diào)，從而引起一系列細胞反應(yīng)，最終調(diào)控細胞增值、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡和化療耐藥性產(chǎn)生等生物學過程[18-19]。相關(guān)研究報道，Hedgehog 通路在大腸癌細胞遷移、侵襲以及化療耐藥性中發(fā)揮重要作用[20-21]。Song等[22]研究發(fā)現(xiàn)ITGB1 能夠通過調(diào)節(jié)Hedgehog 通路介導大腸癌細胞生物學行為。本研究結(jié)果顯示，ITGB1 表達下調(diào)聯(lián)合西妥昔單抗顯著下調(diào)大腸癌細胞中SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc 蛋白表達（P＜0.05）。提示ITGB1 表達下調(diào)可能通過抑制Hedgehog 信號通路增強大腸癌細胞對西妥昔單抗的化療敏感性。

綜上所述，ITGB1 表達下調(diào)能夠顯著增強西妥昔單抗對大腸癌細胞的增殖抑制、周期阻滯及誘導凋亡作用，其機制可能與抑制Hedgehog信號通路的活性有關(guān)。本研究為大腸癌的治療和耐藥機制的研究提供了新思路，但本研究僅在細胞水平開展研究，且未應(yīng)用通路抑制劑證實，后續(xù)還需更多的實驗研究作進一步的證實。