細(xì)胞周期與骨髓增生異常綜合征化療療效的前瞻性分析

詹 揚(yáng) 王麗紅 鐘 龍 陸 佳 徐海濤 楊達(dá)天 陳丹桂 陳 非

骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組異質(zhì)性疾病，其基本病變?yōu)榭寺⌒栽煅杉?xì)胞發(fā)育異常，導(dǎo)致無(wú)效造血，有向急性髓系白血?。ˋML）轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險(xiǎn)。DNA甲基化異常是MDS最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)改變，DNA甲基化可調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。抑制 DNA異常甲基化可顯著改善部分 MDS 患者的病情，延長(zhǎng)其生存期，改善生存質(zhì)量，使更多患者獲益?，F(xiàn)今治療MDS的去甲基化藥物（HMAs）有阿扎胞苷和地西他濱。地西他濱是核苷-脫氧胞苷類似物，可在細(xì)胞中與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合，使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶失活，減少基因組DNA的甲基化水平，促進(jìn)抑癌基因功能恢復(fù)，從而改善MDS患者輸血依賴。地西他濱自2006年首次被FDA批準(zhǔn)使用后，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外中高危MDS的一線治療藥物。地西他濱雖然總體上改善了生存率，但反應(yīng)率低，且難以達(dá)到持續(xù)緩解和長(zhǎng)期益處，特別是在治療過(guò)程中疾病復(fù)發(fā)或喪失原有的療效后，患者預(yù)后都不良。因此臨床上急需預(yù)測(cè)地西他濱去甲基化治療療效的可靠指標(biāo)，預(yù)測(cè)治療療效極為重要，可以調(diào)整個(gè)體化的挽救性治療。本研究旨在利用流式細(xì)胞術(shù)分析中高危MDS患者在接受地西他濱治療之前的細(xì)胞周期，結(jié)合患者療效評(píng)估此類患者的化療效果，以期發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期與化療療效的內(nèi)在聯(lián)系，能夠?qū)χ懈呶DS患者進(jìn)行更加針對(duì)性的化療，從而提高中高危MDS患者的化療效果，提升其預(yù)后生存。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集本院2019年11月-2021年4月收治的中高危MDS患者病例數(shù)50例，篩選其中27例，男16例，女11例，平均年齡（64±12.49）歲。所有患者的診斷均根據(jù)維也納最低診斷標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)FAB分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)安慶醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，外周血樣本的取得均經(jīng)患者知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過(guò)骨髓穿刺、染色體核型及外周血檢查等確診MDS且根據(jù)IPSS-R（International PrognosticScoring System-R）評(píng)分為中高危；臨床資料完整；沒(méi)有其他造血相關(guān)疾?。患{入患者均以地西他濱為主方案治療。②排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)治療藥物過(guò)敏；治療前有嚴(yán)重感染的患者；治療前存在嚴(yán)重的心、腦、肝、腎等重大器官障礙；患有其它重大疾??；存在嚴(yán)重意識(shí)障礙或溝通障礙。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血細(xì)胞周期 收集患者進(jìn)行化療前3～5天的外周血2 mL，外周血進(jìn)行離心后吸取上清，加入PBS，混勻，離心，吸取上清，留管1 mL，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。向試管中加入紅細(xì)胞裂解液，混勻，在室溫避光孵育后立即離心。棄上清，加 PBS 重懸，低速混勻，室溫離心。根據(jù)試劑盒（C1052，碧云天）廠家說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞染色，將樣本避光保存于2 ℃～8 ℃冰箱，3 h內(nèi)上機(jī)（Attune NxT，Thermo），上機(jī)時(shí)用手敲管底輕輕混勻。

1.4 治療方案 患者均注射地西他濱（國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H20120067）進(jìn)行治療，使用劑量為20 mg·m·d，采用靜脈滴注方式進(jìn)行。用藥的時(shí)間為開(kāi)始治療的第1～5天，4周為1個(gè)療程，均治療了4療程。在治療過(guò)程中如有嚴(yán)重的感染及骨髓抑制時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)延長(zhǎng)了治療間隔時(shí)間?；颊咴谥委熯^(guò)程中如有嘔吐、感染等癥狀均進(jìn)行相應(yīng)的治療。

1.5 觀察指標(biāo) 根據(jù)IWG（International Working Group）制定的療效標(biāo)準(zhǔn)對(duì)地西他濱治療后的效果進(jìn)行判斷評(píng)估。療效標(biāo)準(zhǔn)包括完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、骨髓緩解（mCR）、血液學(xué)改善（HI）、疾病穩(wěn)定（SD）、疾病進(jìn)展（PD）等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad 9.0軟件系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床化療療效分析 對(duì)27例患者進(jìn)行了地西他濱治療6個(gè)月后，其中17例病情穩(wěn)定（SD），10例病情惡化（PD），見(jiàn)表1。

表1 患者臨床資料及化療療效分析

2.2 化療療效與細(xì)胞周期的關(guān)系 根據(jù)臨床的化療療效將患者分為化療后病情穩(wěn)定SD和化療后病情惡化PD兩組，對(duì)這兩組患者在化療前3～5天的細(xì)胞周期進(jìn)行分析（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)病情穩(wěn)定SD組和病情惡化PD組的G0/G1期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在S期，病情穩(wěn)定SD組與病情惡化PD組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在G2/M期，病情穩(wěn)定SD組與病情惡化PD組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明化療療效與化療之前的細(xì)胞周期（G0/G1、S、G2/M）均無(wú)關(guān)聯(lián)性（P＞0.05）。

表2 地西他濱化療療效與細(xì)胞周期的關(guān)聯(lián)性分析

3 討 論

MDS的特點(diǎn)是髓系細(xì)胞分化或發(fā)育異常，臨床表現(xiàn)為難治的一系或者多系細(xì)胞減少的血液病，多發(fā)于老年人。目前，臨床上治療MDS可通過(guò)造血干細(xì)胞移植來(lái)進(jìn)行治療，但受其它各方面因素影響，該療法在臨床上的應(yīng)用不多。臨床上多采用去甲基化藥物HMAs（阿扎胞苷和地西他濱）對(duì)MDS進(jìn)行化療治療。地西他濱進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在脫氧胞苷激酶的作用下被磷酸化成具有活性的物質(zhì)，之后與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合從而對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶的活性進(jìn)行抑制，促使DNA去甲基化，達(dá)到有效治療MDS的目的。雖然地西他濱的治療已被證明可以延長(zhǎng)生存期，但只有40%～60%的患者對(duì)治療有反應(yīng)，反應(yīng)幾乎普遍是短暫的，在2年內(nèi)失去反應(yīng)。一旦對(duì)這些藥物失去反應(yīng)，預(yù)后就很差。地西他濱在臨床上有雙重的治療效果，低濃度的地西他濱能通過(guò)去甲基化對(duì)表達(dá)抑制的基因進(jìn)行激活，有助于細(xì)胞分化；而高濃度的地西他濱則對(duì)細(xì)胞有胞毒作用。因此在臨床上對(duì)地西他濱的化療療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，以提升治療效果，減少不良反應(yīng)就顯得至關(guān)重要。同時(shí)為是否需要提前考慮HMA聯(lián)用化療、BCL-2抑制劑等靶向藥物、免疫治療以及細(xì)胞治療等方案提高患者化療療效提供依據(jù)。

地西他濱作為S期細(xì)胞周期特異性藥物，在多種疾病中均能通過(guò)阻斷細(xì)胞周期S期和G2期抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)在化療藥物治療的機(jī)制中發(fā)揮重要作用，并在一定程度上影響著化療療效。在晚期食管癌中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析食管癌細(xì)胞周期與化療療效之間有一定的關(guān)聯(lián)性，并且高S期的腫瘤對(duì)化療藥物更為敏感，為食管癌化療療效提供新的預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究重點(diǎn)在于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析患者在采用地西他濱治療之前細(xì)胞周期，為研究和預(yù)測(cè)地西他濱化療的療效提供依據(jù)。本研究中在地西他濱治療之后根據(jù)IWG療效評(píng)分將患者分為病情穩(wěn)定SD和病情惡化PD組，發(fā)現(xiàn)這兩組患者在化療之前細(xì)胞周期的G0/G1、S、G2/M期均沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明細(xì)胞周期與地西他濱治療MDS化療效果之間沒(méi)有顯著性的差異。

本研究中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析化療之前細(xì)胞周期用來(lái)追蹤化療療效評(píng)價(jià)，結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞周期與化療療效之間顯著性差異并不顯著。由于我們納入研究的患者只有27例，樣本量較小，所以有一定的局限性，隨著后續(xù)研究深入，納入研究樣本量的增加，可能會(huì)有其它的發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，地西他濱在體外能將MDS-L細(xì)胞阻滯在G0/G1期，阻止G0/G1細(xì)胞向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)化。同時(shí)，地西他濱能抑制白血病細(xì)胞K562的增殖，抑制細(xì)胞周期蛋白CDK2、cyclin E1的表達(dá)，促進(jìn)凋亡。在本研究中我們檢測(cè)的是地西他濱化療之前的細(xì)胞周期，后期的研究中，我們可以增加檢測(cè)地西他濱治療之后的細(xì)胞周期，通過(guò)觀察治療前后的細(xì)胞周期的變化，綜合患者預(yù)后情況，以期將細(xì)胞周期作為MDS療效評(píng)估以及預(yù)后的指標(biāo)。MDS中甲基化異常，而DNA甲基化與細(xì)胞周期有密切關(guān)系。細(xì)胞周期受多種因子調(diào)控，這些因子相互關(guān)聯(lián)、相互制約。大多數(shù)化療藥物可以影響復(fù)制周期中的腫瘤細(xì)胞。因此，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑聯(lián)合化療藥物是一種具有巨大應(yīng)用潛力的抗腫瘤策略。有研究使用去甲基斑蝥素（DMC）抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A），從而加速細(xì)胞分裂以提高FCDDP的治療效果。因此在后續(xù)研究中我們可以根據(jù)細(xì)胞周期的差異變化來(lái)觀察化療藥物的療效，可能在化療過(guò)程中使用細(xì)胞周期抑制劑阻斷細(xì)胞，降低耐藥的影響，提高化療藥物的療效，為MDS的個(gè)性化治療提供依據(jù)。