氧化石墨烯對(duì)藻類的毒性作用研究進(jìn)展*

王仁君， 辛佳藝， 陳峻峰

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165，山東省曲阜市)

0 引 言

氧化石墨烯(Graphene oxide)是石墨烯的氧化物，是由化學(xué)氧化的石墨粉末分離得到的單一原子層，是一種sp2雜化軌道的碳原子組成的六角型呈蜂巢晶格的二維碳納米材料. 2010年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)授予了研制出微機(jī)械剝離法的英國曼徹斯特大學(xué)物理學(xué)家安德烈·蓋姆和康斯坦丁·諾沃肖洛夫，他們應(yīng)用微機(jī)械剝離法成功從石墨中得到石墨烯[1]. 石墨烯的特點(diǎn)是在本身低濃度無明顯毒性的情況下，可與其他物質(zhì)結(jié)合，通過復(fù)合物的形式而顯現(xiàn)出毒性[2]. 氧化石墨烯含有較多的含氧官能團(tuán)，化學(xué)性質(zhì)活潑，表面活性和親水性均較高，在電學(xué)、光學(xué)等方面的獨(dú)特性質(zhì)使其被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[3]. 因其能均勻分散在純水中形成膠體溶液，加大了去除的難度，對(duì)水環(huán)境造成了一定影響[4]，同時(shí)易與其他物質(zhì)結(jié)合從而對(duì)水體中的藻類產(chǎn)生一定影響.

1 研究現(xiàn)狀

1.1 氧化石墨烯的應(yīng)用

氧化石墨烯的制備方法靈活，并且具有較大的比表面積以及優(yōu)異的親水性能，使得其與材料復(fù)合更有利于發(fā)揮作用，近年來在生物醫(yī)藥、光催化和環(huán)境等方面應(yīng)用較為廣泛. 氧化石墨烯負(fù)載滌綸織物對(duì)染料有更高的去除率[5]；改性的氧化石墨烯應(yīng)用于金屬涂層中可減少涂層的缺陷，提高其防腐蝕能力[6]；有機(jī)染料和重金屬等物質(zhì)與氧化石墨烯復(fù)合后可改善吸附性能；氧化石墨烯與常見的抗菌劑如金屬離子、聚胍和納米粒子等復(fù)合后可提高抗菌性能；氧化石墨烯還可應(yīng)用于增強(qiáng)材料的機(jī)械性能，例如氧化石墨烯能夠調(diào)整水泥水化產(chǎn)物的微觀結(jié)構(gòu)使其更利于實(shí)際生活的應(yīng)用[7].

1.2 氧化石墨烯的水環(huán)境行為

石墨烯可分為純石墨烯、氧化石墨烯、還原性氧化石墨烯和少層石墨烯. 純石墨烯的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難以在水中被降解. 氧化石墨烯化學(xué)性質(zhì)活潑，受到自然水體中pH值、離子強(qiáng)度、光照等理化性質(zhì)的影響，會(huì)出現(xiàn)吸附、還原、分散、團(tuán)聚等現(xiàn)象[8]. 氧化石墨烯的毒性和生物效應(yīng)受表面理化性質(zhì)的影響，氧化石墨烯可通過作用于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)以及有相關(guān)功能的蛋白質(zhì)而導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化和功能的異常[9]，從而對(duì)生物產(chǎn)生毒性.

隨著氧化石墨烯的興起與大量使用，在自然水體環(huán)境中也出現(xiàn)了氧化石墨烯的身影，而藻類在水體中占據(jù)著重要的地位，因此氧化石墨烯在水環(huán)境中對(duì)藻類的影響成為了不容忽視的問題. 研究表明，氧化石墨烯的濃度、暴露時(shí)間、在水中分散的穩(wěn)定性[10]和對(duì)物質(zhì)的吸附[11]等因素都會(huì)直接或間接地對(duì)水中藻類造成影響.

2 氧化石墨烯對(duì)藻類的毒性作用

2.1 氧化石墨烯對(duì)藻類生長狀況的影響

藻類的生長狀況所受影響主要是藻密度和EC50.

涂海峰等[12]對(duì)青島大扁藻(Platymonashelgolanidicavar.tingtaoensis)藻密度受氧化石墨烯暴露時(shí)間的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明低濃度(0.1～10 mg/L)氧化石墨烯暴露的前72 h 略微促進(jìn)了扁藻密度的升高，藻密度稍高于空白對(duì)照組；暴露96 h過程中，低濃度的氧化石墨烯對(duì)青島大扁藻的生長有略微的抑制作用，抑制率低于10%，在整個(gè)暴露過程藻密度沒有受到明顯的抑制，可見青島大扁藻對(duì)氧化石墨烯的耐受性較強(qiáng).

張倩等[13]的研究比較了氧化石墨烯對(duì)鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)和海水微綠球藻(Nannochloropsisoceanic)生長狀況的影響，兩種藻的生長均受到顯著的抑制作用，其中鹽生杜氏藻受生長抑制較為嚴(yán)重，氧化石墨烯暴露24 h后藻類幾乎停止生長，72 h EC50值低至13.04 mg/L，而海水微綠球藻72 h EC50值為79.10 mg/L.

Ji等[14]研究表明不同濃度氧化石墨烯對(duì)小球藻(Chlorellavulgaris)作用24 h時(shí)藻細(xì)胞分裂增加，表現(xiàn)為促進(jìn)藻的生長；作用96 h時(shí)藻細(xì)胞分裂下降，對(duì)藻生長起抑制作用.

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)分布廣泛，有豐富的蛋白質(zhì)[15]，湖泊微擬球藻(Nannochloropsislimnetica)也是許多水生動(dòng)物的食物[16]. 彭曉玲等[17]研究發(fā)現(xiàn)在氧化石墨烯暴露24 h之內(nèi)，不同濃度的氧化石墨烯對(duì)藻細(xì)胞的生長均無明顯抑制；在24 h后，兩種藻的生長均受到抑制，氧化石墨烯濃度高的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于濃度低的實(shí)驗(yàn)組抑制程度更高. 氧化石墨烯對(duì)斜生柵藻72 h 的EC50為25.63 mg/L，對(duì)湖泊微擬球藻72 h的 EC50為48.44 mg/L，根據(jù)我國《新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則》(HJ/T154-2004)[18]提出的生態(tài)毒理學(xué)危害性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，氧化石墨烯對(duì)這兩種藻類屬于中等毒性.

滑模負(fù)荷頻率控制器設(shè)計(jì)包括切換面設(shè)計(jì)和控制器設(shè)計(jì)兩個(gè)步驟,以保證系統(tǒng)在有限時(shí)間內(nèi)達(dá)到切換面并穩(wěn)定在滑模面。根據(jù)柴儲(chǔ)混合電力系統(tǒng)負(fù)荷頻率協(xié)調(diào)控制結(jié)構(gòu),將式(4)、式(6)和式(7)分別修改為

王艷秋[19]研究了不同濃度氧化石墨烯對(duì)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)生長的影響，研究表明低濃度(0.1 mg/L，1.0 mg/L)氧化石墨烯的實(shí)驗(yàn)組中，暴露的前24 h內(nèi)藻的密度與對(duì)照組大致相同，對(duì)藻的生長狀況未造成明顯影響；氧化石墨烯暴露48 h后，實(shí)驗(yàn)組的藻密度較之于對(duì)照組明顯降低，藻的生長受到顯著抑制；高濃度(10 mg/L)的氧化石墨烯在整個(gè)暴露過程中對(duì)藻密度均起到明顯的抑制作用.

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在低濃度(10 mg/L以下)氧化石墨烯暴露短時(shí)間(24 h以下)的情況中，藻的生長受到一定的促進(jìn)作用或無顯著變化(見表1)；高濃度(10 mg/L及以上)暴露長時(shí)間(24 h及以上)時(shí)，藻類的生長會(huì)受到顯著抑制. Yin等[20]比較了氧化石墨烯對(duì)綠藻、藍(lán)藻和硅藻的毒性，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯對(duì)藻類的毒性作用程度因藻的種類而異，即藻類具有不同的特性所表現(xiàn)出不同程度的遮光效應(yīng)、氧化應(yīng)激和機(jī)械損傷等現(xiàn)象，能承受氧化石墨烯脅迫的濃度與時(shí)間不同，因而表現(xiàn)出不同的耐受性.

表1 氧化石墨烯(濃度為0.1～10 mg/L)對(duì)藻密度的影響

2.2 氧化石墨烯對(duì)藻類微觀結(jié)構(gòu)的影響

研究發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯在抑制藻生長的同時(shí)，也使藻的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化，較高濃度氧化石墨烯的暴露使藻細(xì)胞的形狀變得不規(guī)則[17]，氧化石墨烯是單一原子層的片層結(jié)構(gòu)，厚度約為0.8～1.0 nm的氧化石墨烯邊緣通常比較尖銳，會(huì)直接對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成損害，如劃破、刺穿細(xì)胞膜等[21]. 氧化石墨烯與藻接觸時(shí)，在藻細(xì)胞周圍形成了一層涂層，細(xì)胞壁由于氧化石墨烯的附著和刺穿變得輪廓模糊，出現(xiàn)了質(zhì)壁分離、葉綠體收縮的現(xiàn)象[17]，同時(shí)使細(xì)胞膜的完整性受到破壞，細(xì)胞膜的完整性在一定程度上可以由細(xì)胞膜的通透性來表示，在對(duì)青島大扁藻的研究中，實(shí)驗(yàn)人員用FDA法實(shí)測熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞數(shù)目的比值來反映藻細(xì)胞通透性的狀況，結(jié)果表明氧化石墨烯的暴露會(huì)使藻細(xì)胞膜的通透性呈現(xiàn)升高的趨勢，而且氧化石墨烯濃度越高、暴露時(shí)間越長，細(xì)胞膜通透性的改變程度越大[12].

2.3 氧化石墨烯對(duì)藻類細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)含量的影響

2.3.1 細(xì)胞內(nèi)的葉綠素含量

在針對(duì)青島大扁藻氧化石墨烯暴露的96 h過程中，不同濃度的氧化石墨烯對(duì)青島大扁藻的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量沒有明顯影響，僅葉綠素a含量略微降低，其降低程度與空白組對(duì)照并不明顯，且葉綠素含量變化均與青島大扁藻的生長情況一致，這表明了氧化石墨烯對(duì)青島大扁藻為低毒性[12]. 這與Tang等[22]研究氧化石墨烯對(duì)銅綠微囊藻葉綠素含量的影響作用結(jié)果相似，濃度低于10 mg/L的氧化石墨烯對(duì)藻的光合色素參數(shù)(包括葉綠素a含量)無明顯影響. 但王艷秋等[19]將銅綠微囊藻暴露在氧化石墨烯與氧化石墨烯量子點(diǎn)中時(shí)，結(jié)果表明在0.1～10 mg/L濃度范圍內(nèi)的納米材料便能引起銅綠微囊藻葉綠素含量的大幅增加，此實(shí)驗(yàn)組中所用納米材料直徑為 20～50 nm，Tang等使用的氧化石墨烯水懸浮液的平均水動(dòng)力直徑為588±5 nm，兩結(jié)果不一致的原因可能為兩實(shí)驗(yàn)組所用氧化石墨烯純度、直徑、形狀等性質(zhì)不同，使得氧化石墨烯的生態(tài)毒性有所不同[23]. 而斜生柵藻的光合色素受氧化石墨烯影響較為明顯，在與對(duì)照組的比較中，低濃度(10 mg/L)氧化石墨烯的處理組中藻光合色素的含量會(huì)顯著升高或無明顯變化，高濃度(100 mg/L)處理組中藻光合色素含量一般會(huì)明顯降低[13].

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，高濃度(10 mg/L以上)的氧化石墨烯可引起藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量的大幅增加，這是由于氧化石墨烯附著在細(xì)胞表面而產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)，使得藻細(xì)胞對(duì)光的利用減少[24,25]，為了維持光合作用的水平，此時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種應(yīng)激效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)的負(fù)反饋機(jī)制使得保護(hù)性基因表達(dá)從而產(chǎn)生更多的葉綠素，增加對(duì)光的吸收，提高對(duì)光的利用能力[23,26]. 而在高濃度實(shí)驗(yàn)組中，氧化石墨烯含量增大超出了藻細(xì)胞可自我調(diào)節(jié)的范圍，使葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，體積縮小，光合色素分子受損或者合成代謝受阻，對(duì)藻的光合作用產(chǎn)生了抑制[27]. 結(jié)果同時(shí)表明光合參數(shù)可用于測定氧化石墨烯對(duì)藻的毒性效應(yīng)[22].

蛋白質(zhì)是藻細(xì)胞正常生理功能的物質(zhì)保障，其含量變化可反映藻細(xì)胞受損情況[28]；藻細(xì)胞內(nèi)的總脂不僅構(gòu)成了細(xì)胞膜的主要組分,也是細(xì)胞能量和碳的儲(chǔ)存庫[29,30]；當(dāng)微藻在不利環(huán)境下生存時(shí)，藻細(xì)胞生長會(huì)受到抑制，胞內(nèi)有機(jī)物積累，使碳水化合物的含量升高[31]. 因此細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、總脂和碳水化合物含量的變化可反映藻細(xì)胞受不利環(huán)境影響的程度.

在比較斜生柵藻和湖泊微擬球藻的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于藻細(xì)胞內(nèi)部的成分，兩種藻的總蛋白質(zhì)含量在不同濃度氧化石墨烯脅迫下均呈現(xiàn)增加的現(xiàn)象. 低濃度(10 mg/L)實(shí)驗(yàn)組中，兩種藻的碳水化合物含量均上升，且只有湖泊微擬球藻的總脂含量明顯上升；高濃度(100 mg/L)實(shí)驗(yàn)組中，兩種藻的總脂含量均明顯上升，斜生柵藻的碳水化合物含量降低，湖泊微擬球藻的碳水化合物含量升高[17].

張倩[13]將兩種海水藻——鹽生杜氏藻和海水微綠球藻分別置于氧化石墨烯濃度為0 mg/L，10 mg/L和100 mg/L的培養(yǎng)基中處理72 h后，蛋白質(zhì)含量和總脂含量均表現(xiàn)為顯著增加，隨著氧化石墨烯濃度的升高，藻體內(nèi)的總脂含量以及蛋白質(zhì)含量均顯著高于對(duì)照組，其中海水微綠球藻在高濃度(100 mg/L)的氧化石墨烯處理中表現(xiàn)為總脂含量比對(duì)照組增加了3.56倍，蛋白質(zhì)總量比對(duì)照組增加了3.99倍. 在藻細(xì)胞內(nèi)碳水化合物含量的測定中發(fā)現(xiàn)，鹽生杜氏藻在氧化石墨烯低濃度組處理下碳水化合物含量升高，高濃度組含量降低，而海水微綠球藻細(xì)胞內(nèi)碳水化合物含量無顯著變化(見下頁表2).

表2 氧化石墨烯對(duì)藻類細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)含量的影響

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，一定濃度范圍內(nèi)的氧化石墨烯能夠使藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、總脂和碳水化合物含量增加，以提供能量來產(chǎn)生具有保護(hù)性的酶和化合物，以此適應(yīng)脅迫[32]，對(duì)細(xì)胞的生理代謝功能的影響較為重要；當(dāng)氧化石墨烯濃度過高時(shí)，會(huì)影響一些藻類碳水化合物的合成或與碳水化合物反應(yīng)而破壞其結(jié)構(gòu)，致使碳水化合物含量降低[13].

3 存在的問題

研究者在氧化石墨烯對(duì)藻類的毒性作用方面已經(jīng)進(jìn)行了大量研究并取得了重要成果，但目前氧化石墨烯對(duì)生物的致毒機(jī)理并不太明確，在更高水平上對(duì)氧化石墨烯的研究仍然存在著許多空白.

(1)氧化石墨烯與金屬等物質(zhì)對(duì)藻類的聯(lián)合毒性研究較少，氧化石墨烯在天然水體中的毒性以及與其他污染物的聯(lián)合毒性都可能發(fā)生變化，氧化石墨烯的暴露對(duì)水中其他生物如無脊椎動(dòng)物、魚類等也具有一定影響[33,34].

(2)由于氧化石墨烯氧化制備方法的差異，各實(shí)驗(yàn)環(huán)境與所用氧化石墨烯的理化性質(zhì)不盡相同，其研究結(jié)果就會(huì)存在差異甚至相反. 比如Malina等[35]的研究表明氧化石墨烯氧化程度的差異對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響差異較大，主要表現(xiàn)為氧化程度較輕的氧化石墨烯樣品對(duì)膜完整性的損傷明顯大于氧化程度較高的樣品，原因是高氧化程度的氧化石墨烯廣泛的表面功能化阻止了與細(xì)胞膜的直接物理相互作用. 除此之外，氧化石墨烯的性質(zhì)差異還表現(xiàn)在片層的厚度和形狀、表面電荷、表面含氧官能團(tuán)的種類及數(shù)量等方面，因此氧化石墨烯理化性質(zhì)的差異性給其毒性效應(yīng)的評(píng)估帶來了困難.

(3)現(xiàn)階段大多數(shù)研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的，而在實(shí)際水體環(huán)境中氧化石墨烯的轉(zhuǎn)化是多樣的. 比如Zhao等[36]的研究發(fā)現(xiàn)光轉(zhuǎn)化使得氧化石墨烯對(duì)小球藻的毒性顯著升高，釋放副產(chǎn)物增強(qiáng)了對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制作用，表明光照也是改變氧化石墨烯毒性的因素之一. 所以在實(shí)際水環(huán)境中，水體的鹽度、水的流動(dòng)性、氧化石墨烯在可見光下的還原[37]、水中離子的轉(zhuǎn)化和吸附等因素均有可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而改變氧化石墨烯的存在形式，影響其生態(tài)毒性. 自然條件下氧化石墨烯還可能與各種生物之間發(fā)生復(fù)雜的相互作用，這成為自然條件下進(jìn)行氧化石墨烯毒性評(píng)估的一大阻礙.

4 研究展望

氧化石墨烯現(xiàn)今作為具有多種特殊性能的新型材料被廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域，有著巨大的發(fā)展?jié)摿? 比如被用作高效吸附材料來吸附水中有機(jī)和無機(jī)污染物質(zhì)[38]，因其具有的生物相容性[39]和抗菌性等優(yōu)良性狀被用來制作有多種特殊性能的納米材料[40]，氧化石墨烯與其他物質(zhì)的結(jié)合更是擁有著廣闊的發(fā)展前景. 隨著氧化石墨烯的興起與大量使用，其不可避免地進(jìn)入到自然環(huán)境中，氧化石墨烯具有的強(qiáng)吸附能力、親水性等性質(zhì)，使其進(jìn)入到土壤中、水體中難以被去除，對(duì)土壤中的秀麗隱桿線蟲、潮蟲、植物、水體中的魚類和藻類產(chǎn)生一定的生物毒性[41]，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成一定的影響.

對(duì)現(xiàn)階段的研究進(jìn)行總結(jié)和分析，未來研究可從以下幾個(gè)方面開展.

(1)氧化石墨烯的吸附性能使其易于與有機(jī)物質(zhì)、金屬離子等物質(zhì)結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)，從而使其生物毒性發(fā)生改變，所以需開展氧化石墨烯與不同物質(zhì)組合對(duì)藻類產(chǎn)生聯(lián)合毒性的探究.

(2)氧化石墨烯在自然水體中受環(huán)境物理?xiàng)l件、生物條件的影響可發(fā)生理化性質(zhì)的改變，需進(jìn)行氧化石墨烯在實(shí)際自然環(huán)境中的追蹤，探究多因素影響下氧化石墨烯性質(zhì)的變化，在更高水平上對(duì)其致毒機(jī)理開展研究.

(3)如何有效、快速地將氧化石墨烯從自然環(huán)境中分離出來、如何進(jìn)行材料的循環(huán)再生以及妥善處理廢棄的氧化石墨烯材料，也是現(xiàn)階段亟待解決的問題.