川黃柏中原小檗堿型生物堿及其細胞毒性研究*

閆玉鑫， 楊穎， 池利昆， 鄭萍

(云南師范大學 職業(yè)技術教育學院，云南 昆明 650092)

川黃柏(PhellodendronchinenseSchneid.)又名川黃檗或黃皮樹等，是蕓香科(Rutaceae)黃柏屬(Phellodendron)植物，其干燥樹皮作為中藥黃柏的基源植物收載于《中國藥典》2020年版一部.川黃柏味苦，性寒，歸腎和膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、解毒療瘡和瀉火除蒸的功效，主治濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢和熱淋澀痛等.川黃柏中主要含有生物堿類、酚酸類和黃酮類等化學成分[1-3].其中生物堿是黃柏主要成分，含量高達3%以上，主要包括鹽酸小檗堿、藥根堿、巴馬汀和掌葉防己堿等原小檗堿型四氫異喹啉類生物堿.本課題組前期對川黃柏干燥莖進行了系統(tǒng)的化學成分研究，分離得到包含小檗堿在內(nèi)的7個化合物[4].本研究對前期分離得到的大量成分小檗堿多次重結(jié)晶后，發(fā)現(xiàn)其母液的硅膠TLC板有多個生物堿樣品點，進一步分離后得到4個成分(1-4)，對二氫小檗堿(1)的核磁共振(NMR)譜進行詳細歸屬，對hediamine(2)的構(gòu)型用X單晶衍射證實.采用人肝癌細胞(HepG2)對所得化合物進行細胞毒性篩選，化合物1 對HepG2生長的抑制作用較強，IC50值為0.18 μmol/L.

1 儀器與材料

1.1 藥材

川黃柏購買于陜西省西安市藥材市場，經(jīng)中國科學院昆明植物研究所李錫文教授鑒定為蕓香科黃柏屬植物川黃柏(PhellodendronchinenseSchneid.)的莖.

1.2 儀器

紫外光譜由日本Shimadzu公司生產(chǎn)的UV-2600測定；紅外光譜由日本Shimadzu公司生產(chǎn)的IR-450測定；質(zhì)譜由英國Micromass公司生產(chǎn)的VG Autospec-3000質(zhì)譜儀測定；NMR譜由Bruker AV-400和DRX-500核磁共振儀測定，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標.96孔培養(yǎng)板、酶聯(lián)免疫檢測儀和二氧化碳培養(yǎng)箱為法國Thermo-Napco公司產(chǎn)品.

1.3 材料

柱色譜用硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品(48～75 μm)；堿性氧化鋁為上海盛亞化工有限公司產(chǎn)品(38～48 μm)；反相硅膠為Merk公司生產(chǎn)的Lichroprep RP-18(40～63 μm)；Sephadex LH-20為Pharmacia公司產(chǎn)品；薄層色譜材料為青島海洋化工廠生產(chǎn)的GF254硅膠高效板；生物堿顯色劑為自配的改良碘化鉍鉀試劑.3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)為德國sigma-aldrich公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO)為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品，順鉑(DDP)為昆明貴研藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號：20191102；人肝癌細胞(HepG2)來自昆明理工大學衰老與腫瘤分子遺傳學實驗室.

2 提取和分離

干燥的川黃柏莖粉碎成粉末(30.0 kg)經(jīng)95%甲醇加熱回流提取3次(3×50 L，8 h)，合并提取液，濃縮，加0.01 mol/L鹽酸水溶液5 000 mL稀釋，分別用乙酸乙酯萃取三次，得到非生物堿部分.酸水液用2%氫氧化鈉堿化至pH=10，用氯仿萃取三次得到生物堿部分(280 g).氯仿萃取部分反復上硅膠柱層析、SephadexLH-20和RP-18硅膠柱層析得到小檗堿(18 g)，再經(jīng)多次甲醇溶液重結(jié)晶，其母液顯示多個樣品點.母液經(jīng)硅膠柱色譜分離，最后用石油醚-乙酸乙酯(體積比25∶1)、SephadexLH-20和堿性氧化鋁反復柱層析得到化合物1(12 mg)、2(13 mg)、3和4(7 mg)，其中化合物3和4為白色羽狀結(jié)晶，是兩個化合物的混晶.

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色結(jié)晶，改良碘化鉍鉀顯橘紅色.EI-MSm/z：338[M+H]+，分子式C20H20NO4；1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ：6.61(s，H-1)，7.17(s，H-4)，3.34，2.74(m，H-5)，3.85，3.70(m，H-6)，6.87(d，J=8.5，H-11)，6.97(d，J=8.5，H-12)，6.10(s，H-13)，5.67(s，H-14)，5.94(s，O-CH2-O)，3.87(s，OCH3)，3.94(s，OCH3).13C-NMR(CDCl3，500MHz)：108.1(t，C-1)，146.3(t，C-2)，147.4(d，C-3)，104.1(s，C-4)，128.7(d，C-4a)，30.4(t，C-5)，51.5(t，C-6)，137.5(d，C-8)，114.8(s，C-8a)，149.6(s，C-9)，146.7(t，C-10)，118.6(t，C-11)，114.4(s，C-12)，129.2(s，C-12a)，97.4(t，C-13)，73.4(d，C-14)，124.9(d，C-14a)，101.0(t，O-CH2-O)，61.0(q，OCH3)，56.2(q，OCH3).在HMBC譜中H-14(δH5.67)與C-5(δC30.4)、C-8(δC137.5)、C-8a(δC114.8)和C-12a(δC129.2)相關；H-6(δH3.85，3.70)與C-14(δC73.4)相關；H-5(δH3.34，2.74)與C-6、C-1(δC108.1)和C-4a(δC128.7)相關.綜合以上光譜數(shù)據(jù)與已知化合物pachycanthine數(shù)據(jù)比較[5]，鑒定化合物1為pachycanthine，即二氫小檗堿.

化合物2：無色結(jié)晶，改良碘化鉍鉀顯橘紅色.EI-MSm/z：366[M+H]+，分子式C21H20NO5；1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ：6.43(s，H-1)，6.74(s，H-4)，1.63(m，H-5)，2.84(m，H-6)，6.46(d，J=2.0 H-9)，7.39(dd，J=8.0,2.0，H-11)，6.49(d,J=8.0，H-12)，3.90(6H，s，OCH3).13C-NMR(CDCl3，500MHz)：113.0(d，C-1)，145.7(s，C-2)，149.8(s，C-3)，117.3(d，C-4)，133.5(s，C-4a)，26.4(t，C-5)，46.4(t，C-6)，166.0(s，C-8)，124.5(d，C-9)，125.2(s，C-9a)，156.3(s，C-10)，122.7(d，C-12)，133.5(d，C-13)，130.1(s，C-13a)，123.6(d，C-14)，136.5(s，C-15a)，56.6(q，OCH3).綜合以上光譜數(shù)據(jù)與已知化合物hediamine數(shù)據(jù)比較[6]，鑒定化合物2為hediamine，對其X-單晶衍射分析進一步確定其絕對構(gòu)型.

化合物3：無色結(jié)晶，改良碘化鉍鉀顯橘紅色.EI-MSm/z：298[M+H]+，分子式C18H20NO3；1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ：6.40(s，H-1)，6.74(s，H-4)，6.62(d，J=2.5 H-9)，7.09(dd，J=8.2,2.5，H-11)，6.64(d，J=8.2，H-12)，3.76(s，OCH3)，2.23(s，NCH3).13C-NMR(CDCl3，500MHz)：106.9(d，C-1)，145.4(s，C-2)，148.9(s，C-3)，116.5(d，C-4)，131.4(s，C-4a)，24.8(t，C-5)，45.6(t，C-6)，165.7(s，C-8)，122.3(s，C-8a)，122.8(d，C-9)，151.6(s，C-10)，121.5(d，C-11)，131.4(d，C-12)，129.8(s，C-12a)，36.9(t，C-13)，62.8(d，C-14)，134.6(s，C-14a)，56.3(q，OCH3)，42.6(q，NCH3).綜合以上光譜數(shù)據(jù)與已知化合物2-methoxy-berbin-10-ol數(shù)據(jù)比較[7]，鑒定化合物3為2-methoxy-berbin-10-ol.

圖1 pachycanthine的HMBC譜

圖2 hediamine的單晶結(jié)構(gòu)(碳編號為隨意編號)

化合物4：無色結(jié)晶，改良碘化鉍鉀顯橘紅色.EI-MSm/z：298[M+H]+，分子式C18H20NO3；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：6.43(s，H-1)，6.74(s，H-4)，6.46(d，J=2.0 H-9)，7.39(dd，J=8.0,2.0，H-11)，6.49(d,J=8.0，H-12)，3.90(s，OCH3)，2.55(s，NCH3).13C-NMR(CDCl3，500MHz)：113.0(d，C-1)，145.7(s，C-2)，149.8(s，C-3)，117.3(d，C-4)，133.5(s，C-4a)，26.4(t，C-5)，46.4(t，C-6)，166.0(s，C-8)，125.2(s，C-8a)，124.5(d，C-9)，156.3(s，C-10)，122.7(d，C-11)，133.5(d，C-12)，130.1(s，C-12a)，38.9(t，C-13)，64.9(d，C-14)，136.5(s，C-14a)，56.6(q，OCH3)，43.1(q，NCH3).綜合以上光譜數(shù)據(jù)與已知化合物3-methoxy-berbin-10-ol數(shù)據(jù)比較[7]，鑒定化合物4為3-methoxy-berbin-10-ol.

4 體外抗腫瘤活性檢測

取處于對數(shù)生長期的人肝癌細胞調(diào)整到一定的細胞濃度后加入96孔培養(yǎng)板，每孔90 μL.待培養(yǎng)24 h細胞貼壁后加入受試樣品.樣品設 0.01、0.1、1、10 μg/mL和100 μg/mL 5個受試濃度，每個濃度設3個平行孔，每孔10 μL.陰性對照為等體積生理鹽水.溶媒對照為對應于10 μg/mL和100 μg/mL 兩個高濃度樣品的DMSO，分別為0.02%和0.2%.陽性對照為10 μg/mL等體積的DDP.加藥后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入MTT(5 mg/mL)，每孔 20 μL，培養(yǎng)4 h，再加入三聯(lián)液(10% SDS-5%異丁醇-0.012 mol/L HCl(w/v/v))溶解，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)12～20 h，用酶標儀在570 nm單波長下測定各孔的OD值.計算樣品不同濃度的OD值均數(shù)，按下列公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率=(OD對照孔-OD受試孔)/OD對照孔× 100%，采用LOGIT法計算半數(shù)抑制濃度IC50.化合物1、2和3與4混合物對人肝癌細胞的生物活性十分明顯，IC50值分別為0.18、3.49 μmol/L和 6.15 μmol/L.

5 討論

小檗堿是從多種植物中分離得到的具有廣譜抗菌和體外抗腫瘤作用的生物堿，川黃柏主產(chǎn)于我國南方各省，為提取小檗堿的原料之一.本試驗對川黃柏莖的化學成分進行研究，運用多種分離純化技術和鑒定技術，從小檗堿粗提物中發(fā)現(xiàn)4個小檗堿類型生物堿，對其核磁數(shù)據(jù)進行了準確歸屬，并研究其對人肝癌細胞的生物活性.進一步證明了小檗堿類化合物具有顯著細胞毒性，為合理開發(fā)利用該類成分奠定了理論基礎.