鹽酸右美托咪定對膿毒癥急性肺損傷小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶7抑制作用研究

齊穎，陳兵

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院ICU，天津 300211）

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)科常見病，病死率較高且預(yù)后差，臨床常見的感染源是肺部感染，此外有腹腔感染及泌尿系統(tǒng)等感染。膿毒癥常累及呼吸系統(tǒng)，在機(jī)械通氣患者中治療效果欠佳，存在院內(nèi)感染的高風(fēng)險(xiǎn)，適度的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛可有效緩解患者痛苦及焦慮，該類患者病情進(jìn)展迅速常合并急性肺損傷（acute lung injury，ALI）甚至急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），即使康復(fù)后部分患者也可能出現(xiàn)肺組織纖維化，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）7是Wnt/β連環(huán)蛋白的靶基因產(chǎn)物，在膿毒癥致ALI/ARDS的早期激活，它可破壞肺組織的正常結(jié)構(gòu)，在部分病例中引起肺纖維化[1]。右美托咪定是ICU常用的鎮(zhèn)靜藥物，該藥對患者呼吸抑制作用弱、無蘇醒延遲，恰當(dāng)應(yīng)用該藥物能減少患者機(jī)械通氣時間及呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎發(fā)生率，該藥產(chǎn)生的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗炎作用能減輕肺水腫程度[2]。其治療機(jī)制可能是通過抗氧化應(yīng)激、改善巨噬細(xì)胞聚集從而抑制炎癥因子的釋放，起到臟器保護(hù)的作用。MMP7在肺損傷早期升高，具有一定程度致纖維化的作用，通過研究該酶在急性肺損傷小鼠的表達(dá)水平來進(jìn)行早期肺損傷的診斷[3]。本研究建立膿毒癥致小鼠ALI模型，通過光鏡和電鏡下觀察肺組織病理改變及檢測不同時間點(diǎn)血清MMP7濃度變化，研究右美托咪定對急性肺損傷小鼠的肺保護(hù)作用。

1 材料及方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)動物為雄性昆明小鼠，體重20~25g。大腸桿菌脂多糖購自Sigma（血清型055：B5），鹽酸右美托咪定注射液（2 ml：0.2 mg）購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，部分試劑由天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將96只小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對照組、ALI組、治療組，每組32只；每組各分為1、3、5、8 h 4個不同的損傷時間點(diǎn)。ALI組及治療組腹腔注射脂多糖10 mg/kg。對照組注射等劑量生理鹽水，治療組在脂多糖注射結(jié)束后半小時經(jīng)腹腔注射右美托咪定25μg/kg。小鼠在注射脂多糖40 min左右出現(xiàn)嗜睡、寒戰(zhàn)、呼吸頻率增快、進(jìn)食及飲水減少，部分小鼠并出現(xiàn)腹瀉等表現(xiàn)。光鏡下觀察病理改變，ALI組肺組織肺泡間隔增厚，血細(xì)胞及炎性細(xì)胞滲出到肺泡腔內(nèi)，表示造模成功。

1.2.2 標(biāo)本收集及處理 到達(dá)相應(yīng)的處理時間點(diǎn)，將小鼠麻醉完全后從內(nèi)眥取血低溫3 000 r/min離心15 min保留上清至-20℃冰箱備用。右肺下葉組織浸泡在10%福爾馬林，保存至4℃冰箱，光鏡下觀察組織病理改變。右肺中上葉進(jìn)行肺組織勻漿提取蛋白質(zhì)。左肺組織保存在2.5%戊二醛進(jìn)行電子染色，在透射電鏡下觀察肺血管內(nèi)皮的變化。

1.2.3 Western印跡檢測 小鼠肺組織勻漿提取蛋白樣本保存于-80℃。提取的蛋白質(zhì)按照試劑盒進(jìn)行操作：（1）取20μg/孔蛋白質(zhì)進(jìn)行10%SDS-PAGE。（2）配膠上樣（上層膠5%，下層膠10%）。電泳（上層膠60 V，下層膠120 V）。（3）切所需部分放入1×轉(zhuǎn)膜緩沖液。將PVDF膜也放入轉(zhuǎn)膜緩沖液。（4）取出PVDF膜做標(biāo)記后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。（5）一抗（MMP-7 1：1 000優(yōu)寧維，β-actin 1：10 000）4℃孵育過夜。（6）1×TBST洗15 min，重復(fù)3次。（7）二抗（1：4 000聯(lián)科）室溫孵育2 h。（8）1×TBST洗15 min×3次。（9）暗室顯影：壓片、曝光、顯影、定影。（10）分析結(jié)果。

1.2.4 血清MMP-7濃度的測定 采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別測定損傷1、3、5、8 h血清MMP-7濃度，嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)由SPSS21.0及Graphpad prism7、ImageJ軟件進(jìn)行分析及作圖。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理改變對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁無增厚，肺泡腔無液體及血細(xì)胞滲出，隨著損傷時間的延長，損傷組肺組織的結(jié)構(gòu)逐漸破壞加重，肺泡壁增厚明顯，肺泡皺縮，肺泡腔內(nèi)血細(xì)胞滲出，炎性細(xì)胞滲出，到損傷5 h時，肺泡的結(jié)構(gòu)幾乎塌陷，炎性細(xì)胞浸潤，甚至形成透明膜。與同時間點(diǎn)損傷組相比較，治療組肺組織炎癥緩解，炎性細(xì)胞滲出減少，肺組織病變程度減輕（圖1）。

圖1 3組小鼠在不同時間點(diǎn)肺組織病理結(jié)構(gòu)的改變Fig 1 Changes of pathological structure of lung tissue in three groups of mice at different time

2.2 不同時間點(diǎn)測定小鼠血清MMP7濃度治療組血清MMP-7濃度較同時間點(diǎn)ALI組降低（P＜0.01）（表1）。

表1 各組不同時間點(diǎn)血清MMP7濃度（pg/mL）Tab 1 Serum MMP7 concentration at different time in each group（pg/mL）

2.3 電鏡下觀察肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變電鏡下肺損傷3 h時血管內(nèi)皮損傷的變化，對照組肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)空泡較少，無細(xì)胞的腫脹，基膜相對完整（圖2A）。ALI組細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，基膜完整性被破壞（圖2B）。治療組內(nèi)皮基膜的病變程度較損傷組有所減輕（圖2C）。

圖2 電鏡下肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變（放大倍數(shù)10 000×）Fig 2 Changes of pulmonary vascular endothelial cells under electron microscope（magnification power 10 000×）

2.4 Western印跡檢測在損傷3 h時，與對照組相比，ALI組MMP-7的表達(dá)水平較高，治療組MMP-7表達(dá)下降（P＜0.01）（圖3）。

圖3 Western印跡檢測3組MMP-7蛋白的表達(dá)Fig 3 The expression of MMP-7 protein in three groups by Western blotting

3 討論

膿毒癥急性肺損傷（ALI/ARDS）是ICU的常見危重病，感染、創(chuàng)傷、缺血再灌注、胃內(nèi)容物吸入呼吸道均可引起肺損傷的發(fā)生，引起膿毒癥的感染源具有多樣性，臨床以肺部感染為主，其次為腹腔感染及泌尿系感染等。出現(xiàn)ARDS時預(yù)后極差，并且給患者帶來較高的治療費(fèi)用[4]。

膿毒癥肺損傷發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，通過制備動物模型可再現(xiàn)損傷過程的病理機(jī)制，微血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能的變化在急性肺損傷早期起核心作用，免疫系統(tǒng)會釋放大量促炎和抗炎細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α等因子，循環(huán)中高水平的細(xì)胞因子可增強(qiáng)對組織器官的損害，內(nèi)皮屏障破壞后富含蛋白質(zhì)的液體滲出增加，部分大分子物質(zhì)也會進(jìn)入組織間隙和肺泡間隙從而引起肺水腫，有研究表明內(nèi)皮損傷與中性粒細(xì)胞活化有關(guān)[5]；此外，內(nèi)皮細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)皮素-1、血管緊張素-2及前列環(huán)素，它們可調(diào)節(jié)血管舒張及收縮功能，在肺損傷過程中起到重要作用。通過抑制炎癥因子釋放、免疫調(diào)節(jié)治療可產(chǎn)生臟器保護(hù)作用[6]。

右美托咪定是ICU常用的鎮(zhèn)靜劑，臨床應(yīng)用中對患者的呼吸抑制作用較少，因此也常應(yīng)用于圍術(shù)期鎮(zhèn)靜，適當(dāng)?shù)逆?zhèn)靜、鎮(zhèn)痛不僅能使患者克服恐懼心理，還能減少呼吸機(jī)的使用時間，改善患者預(yù)后[7]。右美托咪定作用于藍(lán)斑核，有較高的蛋白結(jié)合率，容易穿過血-腦屏障，通過激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周脊髓的α2腎上腺素能受體而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛及抗交感作用，可抑制氧化作用及抑制細(xì)胞凋亡。研究表明它能一定程度緩解膿毒癥肺損傷的炎性反應(yīng)。其機(jī)制可能是通過抑制核因子-κB（NF-κB）活化，減輕TNF-α等炎癥因子的釋放[8]，減輕肺臟炎癥滲出的程度，延長小鼠的生存時間。應(yīng)用右美托咪定的抗炎機(jī)制可能是通過Toll樣受體4（TLR4）起作用，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可改善線粒體功能從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[11]，可能和改善線粒體通透性相關(guān)，該藥物能抑制下游炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對臟器產(chǎn)生保護(hù)作用，也能降低心肌缺血的并發(fā)癥[12]。

MMP是含鋅的內(nèi)肽酶家族。目前已研究出的有23種不同的MMP，這些酶作為無活性的前體形式進(jìn)行分泌，需要激活才能形成有功能性活性酶[9]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在健康組織中，MMP活性常較低，在病理情況下如炎癥、肺纖維化時該酶會升高。在一項(xiàng)比格犬特發(fā)性肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究中[10]，研究者發(fā)現(xiàn)MMP高表達(dá)，能破壞細(xì)胞間的機(jī)制及細(xì)胞間的連接，其作用可導(dǎo)致早期的肺纖維化，給臨床治療帶來極大的困難，因此預(yù)防早期肺臟的纖維化有很必要的作用。通過測定循環(huán)中MMP7的表達(dá)可早期識別肺損傷并且進(jìn)行早期干預(yù)[13]，早期觀察到血管內(nèi)皮損傷，采取恰當(dāng)?shù)闹委煷胧└纳苹颊哳A(yù)后。MMPs的過度表達(dá)導(dǎo)致肺組織損傷和重塑，如果能抑制MMPs表達(dá)則可能作為治療ALI/ARDS的一種新的潛在方法[14]。右美托咪定能一定程度抑制MMP7的表達(dá)，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[15]。

本實(shí)驗(yàn)中，治療組小鼠血清MMP7表達(dá)降低，光鏡下觀察肺組織炎性滲出較對照組減少，電鏡觀察肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度減輕，表明在膿毒癥急性肺損傷早期給以右美托咪定治療后，能夠抑制炎性因子的釋放，減輕肺血管內(nèi)皮損傷，有效抑制肺纖維化進(jìn)展。

綜上所述，右美托咪定降低膿毒癥急性肺損傷MMP7表達(dá)，抑制炎性因子釋放，對血管內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用。對于膿毒癥急性肺損傷的治療具有一定指導(dǎo)意義。但右美托咪定抑制MMP7產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確，動物實(shí)驗(yàn)對于臨床治療的指導(dǎo)意義有待后續(xù)進(jìn)一步探討。