山柰酚對大鼠高原肺水腫的預(yù)防作用及機制研究

曹麗睿，查玉杰，何慶

（1.西南交通大學醫(yī)學院，成都 610036；2.西南交通大學附屬醫(yī)院成都市第三人民醫(yī)院，成都 610030）

高原肺水腫（high altitude pulmonary edema，HAPE）是一種嚴重的急性高原疾病，是快速上升至海拔超過2 500 m的高原環(huán)境時，機體對高原低壓低氧環(huán)境不適應(yīng)所引起的特發(fā)性疾病[1-2]，HAPE起病迅速且死亡率高[3-4]，對需要急進高原地區(qū)的人群危害極大，嚴重者可能會危及生命[4-5]。近年來隨著川藏地區(qū)經(jīng)濟建設(shè)和高原作業(yè)的不斷增多，需要從低海拔地區(qū)進入高原環(huán)境的人群數(shù)量逐年增加，急性高山病（acute mountain sickness，AMS）的發(fā)病率持續(xù)升高[6]。如何使平原地區(qū)人群進入高原地區(qū)后快速適應(yīng)高原環(huán)境，提高生活質(zhì)量和工作能力，減少HAPE的發(fā)病率，是目前急需解決的問題。盡管已有研究對AMS和HAPE的機制和防治措施進行探索，但可以用于臨床且療效和安全性都有一定保障的預(yù)防和治療措施仍然比較缺乏，因此加強HAPE及其相關(guān)防治藥物的研究，具有重大的臨床意義。

山柰酚（kaempferol，KA）又名山柰酚-3，是一種黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[7-9]。有實驗研究表明山柰酚能夠清除氧自由基，抑制炎性細胞因子產(chǎn)生，保護組織免受缺氧損傷[10]，而HAPE的產(chǎn)生與炎癥、氧化應(yīng)激增強密切相關(guān)[11-12]，因此猜測山柰酚對HAPE也具有一定的防治作用，但目前對于山柰酚預(yù)防HAPE的作用及相關(guān)機制研究還未見報道。

本研究利用高原性疾病環(huán)境模擬系統(tǒng)模擬海拔6 000 m高原環(huán)境以建立HAPE大鼠模型，以乙酰唑胺作為對照組，通過預(yù)給藥的方式探討山柰酚是否通過緩解氧化應(yīng)激和炎癥作用對HAPE大鼠產(chǎn)生保護作用以及可能存在的相關(guān)機制，以期為山柰酚的臨床運用和HAPE的防治提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6~7周齡的SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠32只，體重180~220 g，購于成都達碩實驗動物有限公司，實驗單位動物使用許可證編號：SYXK（川）2019-189。飼養(yǎng)于SPF級動物飼養(yǎng)中心，室溫保持20~24℃，相對濕度維持45~65%，人工光照晝夜12 h循環(huán)，大鼠自由進食、飲水。

1.1.2 實驗試劑 山柰酚（原料藥，純度＞98.5%，成都埃法生物科技有限公司，AB0715），乙酰唑胺（原料藥，純度≥98%，上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司，HY-B0782），Tweeen-80（Amresco，BDH7781-2），RNA提取液、5×蛋白還原型上樣緩沖液、HRP標記山羊抗大鼠、HRP標記山羊抗兔、β-actin、GAPDH（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為G3013、G2013、GB23302、GB23303、GB12002、GB12003）。丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A003-1、A014-2-2、A001-1）；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號分別為L200807450、L200927099）；BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為G2026、G2003）。

1.1.3 實驗儀器 高原性疾病環(huán)境模擬系統(tǒng)（成都達碩生物科技有限公司，DS-F），酶標檢測儀（BioTek儀器有限公司），電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，ME203E/02），臺式高速冷凍離心機（北京大龍，D3024R），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），全景切片掃描儀[（3DHISTECH（Hungary）]，電子顯微鏡（日本Nikon電子公司，Eclipse Ci-L），熒光定量PCR儀（Bio-rad，CFX），超微量分光光度計（Thermo，NanoDrop2000）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模及給藥 將32只6~7周齡的健康SD大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為對照組（N組）、模型組（M組）、山柰酚給藥組（KA組）、乙酰唑胺給藥組（ACZ組）。對照組與模型組生理鹽水灌胃，劑量為10 mL/kg；山柰酚給藥組按10 mL/kg容量灌胃給予大鼠配制好的濃度為10μmol/mL的藥液，乙酰唑胺組根據(jù)體表面積折算法，將臨床常用的人體用藥劑量折算為大鼠的用藥劑量，按照44.66 mg/kg劑量給藥。各實驗組每日均灌胃給藥1次，持續(xù)7 d，實驗期間密切觀察大鼠的一般狀況。

第8天N組給藥后仍照常飼養(yǎng)，其余3組在給藥1 h后放入模擬海拔6 000 m低氧環(huán)境的低壓氧艙內(nèi)（動物進艙后以10 m/s速度減壓上升，10 min達到海拔6 000 m，氧含量9.8%，之后維持氧含量在9.7%~9.9%范圍內(nèi)，艙內(nèi)大氣壓維持在46.57~49.02 kPa范圍內(nèi)，濕度維持在49%~55%之間，室內(nèi)溫度由中央空調(diào)統(tǒng)一控制，白天保持22~24℃，夜晚16~18℃。N組大鼠在同一實驗室常壓常氧條件下飼養(yǎng)48 h，其余3組大鼠在低壓低氧艙內(nèi)飼養(yǎng)48 h，維持各組大鼠其他飼養(yǎng)條件相同。飼養(yǎng)結(jié)束后，按N組、M組、KA組、ACZ組的順序依次取出各組大鼠，觀察一般情況、稱量體重并記錄后，腹腔注射10%水合氯醛溶液將大鼠麻醉，無菌條件下解剖。取出整個肺組織，觀察并記錄肺組織的形態(tài)是否正常，以及各組大鼠肺組織的顏色和大小有無差異，將肺組織分解并妥善保存。

1.2.2 大鼠肺含水量測定 取大鼠左上肺組織，生理鹽水沖洗2次，無菌水淋洗3次，用無菌濾紙吸干水分，置于錫箔紙上稱重，得到的肺組織重量記錄為濕重[W（g）]，用錫箔紙包裹好肺組織后置于烘箱中，設(shè)置溫度為80℃，連續(xù)烘干48 h，待肺組織重量恒定后稱重，記錄為干重[D（g）]。根據(jù)公式肺含水量（%）=（濕重－干重）/濕重×100%，計算得到肺含水量。

1.2.3 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肺組織病理學變化 取大鼠左下肺組織，用0.9%的生理鹽水沖洗后，采用4%多聚甲醛溶液固定48 h，等待固定充分后，依次將其進行蠟封、包埋、切片，隨后將切片進行二甲苯脫蠟、清洗、蘇木精和伊紅染色、脫水、中性樹脂封片，光鏡下觀察病理改變并拍照記錄。

1.2.4 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α和IL-6水平 取大鼠右上肺組織，用9倍勻漿介質(zhì)（0.9%生理鹽水）研磨，然后將研磨液3 000~4 000 r/min，離心10 min，取上清制備成10%的組織勻漿，用ELISA試劑盒測定樣本中TNF-α和IL-6水平。所有操作按試劑盒規(guī)定步驟，根據(jù)ELISA標準曲線計算組織樣本中的各個指標含量。

1.2.5 大鼠肺組織NOS、MDA、SOD變化檢測 取大鼠右上肺組織，用9倍勻漿介質(zhì)（0.9%生理鹽水）研磨，然后將研磨液3 000~4 000 r/min，離心10 min，取上清制備成10%的組織勻漿，根據(jù)試劑盒操作要求測定肺組織和血漿中SOD活性、MDA濃度和NOS活性。

1.2.6 Western印跡檢測磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶1（Akt1）蛋白水平 從冰箱中取出大鼠右下肺組織，準確稱量，研磨勻漿，冰上裂解30 min后，離心獲得上清液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后配制SDS-PAGE凝膠（10%分離膠、5%濃縮膠）、電泳、轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Akt1、PI3K、內(nèi)參蛋白β-actin一抗（1∶1 000），4℃孵育搖床過夜后洗滌后加入二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h，孵育結(jié)束后洗滌，ECL反應(yīng)液充分反應(yīng)，壓片并顯影定影，整理去色并分析目標帶的光密度值。

1.2.7 RT-PCR檢測PI3K、Akt1 mRNA水平 取右下肺組織，研磨后提取RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，混勻并離心，設(shè)定好逆轉(zhuǎn)錄程序。在NCBI數(shù)據(jù)庫Nucleotide中查詢大鼠PI3K（NM_053481.2）、Akt1（NM_033230.3）、GAPDH（NM_017008.4）的mRNA相應(yīng)基因號，結(jié)合參考文獻，委托武漢ServiceBio生物科技公司完成引物設(shè)計、合成與驗證，見表1。采用兩步法PCR擴增標準程序進行Real-Time PCR反應(yīng)，使用實時熒光定量PCR儀分析結(jié)果，得出各個樣本的Ct值，采用ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，得到目的基因的相對表達量。

表1 目的基因的引物序列Tab 1 Primer sequence of target genes

1.3 統(tǒng)計學處理本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0軟件處理，作圖工具采用Graphpad Prism 8.01。計量資料采用±s表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗評估變量的正態(tài)性。多組間比較先行方差齊性檢驗（Levene檢驗），若方差齊用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用LSD-t（le ast-significant-difference）檢驗進行組間差異的多重比較。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺含水量與N組比較M組、KA組、ACZ組的肺含水量都有所升高。與N組相比，M組的肺含水量顯著上升（t=17.946，P＜0.01）。與M組相比，KA組的肺含水量降低（t=11.949，P＜0.01），ACZ組與M組相比，肺含水量也呈下降趨勢（t=12.358，P＜0.01）。

圖1 大鼠肺組織含水量Fig 1 Water content in luny tissue of rats

2.2 大鼠肺組織HE染色結(jié)果如圖2所示，N組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理改變，肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡壁未見明顯增厚，也未觀察到炎性細胞浸潤。與N組相比，M組存在明顯的肺組織結(jié)構(gòu)破壞，顯微鏡下可見肺泡塌陷水腫，肺泡壁增厚且厚度不均一，肺泡腔縮小，伴有大量淋巴細胞與中性粒細胞浸潤，局部支氣管管腔狹窄變形，管腔內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤和嗜酸性黏液分泌。KA組和ACZ組可見肺泡壁增厚和肺泡腔縮小伴炎性細胞浸潤，但與M組相比這種變化顯著減輕。

圖2 大鼠肺組織HE染色（200×）Fig 2 HE staining of lung tissue in rats（200×）

2.3 大鼠肺組織炎癥因子TNF-α和IL-6水平變化如圖3所示，與N組比較，M組TNF-α、IL-6水平升高（t=14.753、7.666，均P＜0.01）。與M組相比，KA組TNF-α和IL-6水平均明顯下降（t=9.104、3.843，均P＜0.01）；與M組相比，ACZ組TNF-α、IL-6水平均下降（t=9.299、5.407，均P＜0.01），且KA組與ACZ組之間并無明顯差異（t=0.201、1.564，均P＞0.05）。

圖3 山柰酚干預(yù)后肺組織TNF-α、IL-6含量的變化Fig 3 The changes of TNF-αand IL-6 in the lung tissue of the rats

2.4 大鼠肺組織氧化應(yīng)激指標變化如圖4所示，與N組相比，M組大鼠肺組織SOD活性顯著下降（t=9.663，P＜0.01），MDA含量顯著上升（t=13.906，P＜0.01），NOS活性下降（t=4.681，P＜0.01）；與M組相比，KA組和ACZ組大鼠肺組織的SOD活性上升（t=3.715、4.417，均P＜0.01），MDA含量減少（t=9.196、12.215，P＜0.01），NOS活性上升（t=2.629、4.327，均P＜0.05）；且KA組與ACZ組比較，NOS和SOD均無明顯差異（t=0.135、1.204，均P＞0.05），KA組MDA高于ACZ組（t=3.016，P＜0.05）。

圖4 大鼠肺組織氧化應(yīng)激生化指標變化Fig 4 The changes of levels of oxidative stress in the lung tissue of the rats

2.5 山柰酚干預(yù)后大鼠肺組織中PI3K/Akt通路激活情況檢測如圖5、圖6所示，與N組相比，M組PI3K和Akt1相對含量均顯著升高（t=3.552、7.930，均P＜0.05）。與M組比較，KA組PI3K表達降低（t=6.701，P＜0.01），Akt1表達降低（t=4.010，P＜0.05）。與M組相比，ACZ組PI3K蛋白和Akt1蛋白相對含量略有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（t=1.092、1.414，均P＞0.05）。

圖5 大鼠肺組織PI3K蛋白表達含量的變化Fig 5 The changes of expression of PI3K protein in the lung tissue of the rats

圖6 大鼠肺組織Akt1蛋白表達含量的變化Fig 6 The changes of expression of Akt1 protein in the lung tissue of the rats

2.6 山柰酚干預(yù)后大鼠肺組織中PI3K、Akt1 mRNA表達水平測定 如圖7所示。與N組相比，M組PI3K、Akt1 mRNA相對表達量明顯升高（t=7.069、5.896，均P＜0.01），與M組相比，KA組PI3K、Akt1 mRNA相對表達量降低（t=8.468、5.871，均P＜0.01）。與M組相比，ACZ組PI3K、Akt1mRNA相對表達量降低（t=5.492、3.355，均P＜0.05）。

圖7 大鼠PI3K、Akt1 mRNA相對表達量Fig 7 Expression of PI3K and Akt1 mRNA in the lung tissue of the rats

3 討論

近年來，HAPE作為高原疾病中發(fā)病率和死亡率都較高的一種疾病日漸受到關(guān)注，越來越多的研究說明HAPE的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激失衡、炎癥等相關(guān)[12]。山柰酚廣泛存在于茶葉、花椰菜、洋蔥、番茄、草莓和葡萄等可食用的水果和蔬菜以及銀杏葉、山楂、連翹、山奈等傳統(tǒng)醫(yī)學常用的植物中，安全性較高，具有良好的抗氧化能力和抗炎能力，可以保護組織免受缺氧損傷，而且山柰酚純品的提取技術(shù)已經(jīng)相當成熟，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

氧化應(yīng)激失衡是引起高原肺水腫的因素之一。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其含量高低可以間接反映機體內(nèi)源性氧自由基清除能力，MDA是過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，可以反映脂質(zhì)過氧化程度。急進高原低壓低氧環(huán)境時，SOD的生成和活性受到炎癥因子的抑制，又在清除氧自由基時大量消耗，因此SOD的含量和活性降低，而MDA的含量增加，血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞受損，通透性增加，導致肺水腫[13]。一氧化氮（NO）由NOS以L-精氨酸為底物生成，是重要的血管內(nèi)皮舒張因子。研究表明，NO產(chǎn)生不足可以加重氣道充血滲出，引起肺水腫[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用高原性疾病環(huán)境模擬系統(tǒng)模擬高原環(huán)境可以使大鼠肺組織SOD活性增強，MDA含量增加，NOS活性降低，氧化和抗氧化平衡失調(diào)，引起組織損傷，這種變化與文獻報道的HAPE的改變一致[14]；而山柰酚和乙酰唑胺預(yù)給藥處理可以使大鼠SOD活性降低，MDA含量減少，NOS活性升高，達到抑制氧化應(yīng)激、改善肺水腫狀態(tài)的目的。說明山柰酚具有良好的抗氧化活性，可以通過清除自由基減輕氧化損傷，實現(xiàn)對肺組織的保護作用。

TNF-α和IL-6作為重要的促炎因子，在誘導炎癥細胞浸潤和組織損傷中起到關(guān)鍵作用，其活性的高低可以提示機體的炎癥損傷情況[15-16]。低壓低氧誘導炎癥細胞激活和炎癥因子釋放，炎癥信號在細胞因子和炎癥介質(zhì)中迅速轉(zhuǎn)導放大，氧自由基和蛋白酶被釋放，肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，造成微循環(huán)障礙，肺泡上皮通透性增強，富含蛋白質(zhì)和纖維蛋白的液體滲出，進而引起肺水腫[17]。研究發(fā)現(xiàn)在LPS所誘導的肺損傷模型中，山柰酚可顯著抑制促炎細胞因子TNF-α和IL-6產(chǎn)生，并能顯著抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB活化信號轉(zhuǎn)導通路[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在低壓低氧誘導的HAPE大鼠中，炎癥因子TNF-α、IL-6大量釋放，炎性反應(yīng)增強，而山柰酚預(yù)給藥使大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6的水平下降，炎性反應(yīng)被抑制，肺水腫程度減輕，提示山柰酚可以抑制高原低壓低氧引起的炎性反應(yīng)，進而緩解HAPE。

PI3K是重要的信號轉(zhuǎn)導分子，Akt是PI3K的下游效應(yīng)物，PI3K/Akt信號通路是同時具有蛋白激酶活性和脂類激酶活性的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，活化的Akt可以通過磷酸化下游效應(yīng)因子調(diào)控細胞凋亡和細胞增殖，參與心血管疾病、腫瘤和代謝障礙疾病等多種疾病的病理過程[19]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路也參與急性肺損傷的發(fā)病過程，包括炎癥、肺水腫、氣道重塑和肺氣腫等[20]。

低氧可以刺激PI3K/Akt信號通路活化[21]。研究發(fā)現(xiàn)山柰酚通過抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶（ERK/p38 MAPK）、PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號通路的激活，抑制內(nèi)皮細胞中低氧誘導因子-1α（hypoxia in ducible factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）激活，進而抑制內(nèi)皮細胞血管形成[22-23]。PI3K/Akt信號通路在調(diào)控中性粒細胞活化和炎癥因子釋放的過程中起重要作用[24]，并與氧化應(yīng)激調(diào)控密切相關(guān)[25]。ZEA誘導產(chǎn)生氧化應(yīng)激，山柰酚刺激核因子E2相關(guān)因子2/血紅素氧合酶1（Nrf2/HO-1）級聯(lián)和PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導，減輕炎癥和脂質(zhì)過氧化作用，使抗氧化酶SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶的表達正?；痆26]。右美托咪定可以抑制脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺部炎癥，抑制肺泡壁增厚和出血，減輕肺水腫，并減輕肺組織細胞凋亡和線粒體凋亡信號激活，這種保護作用與PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路抑制密切相關(guān)[27]。金雀異黃酮可以與雌激素受體結(jié)合激活PI3K/Akt/eNOS信號通路，使NO的合成與分泌增加，舒張肺血管[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，與N組相比，M組大鼠肺組織PI3K蛋白和mRNA均明顯上升，Akt1蛋白和mRNA上升，提示低壓低氧誘導PI3K/Akt信號通路激活，刺激炎癥和氧化平衡失調(diào)，進而促進HAPE的發(fā)生、發(fā)展。與M組相比，KA組大鼠肺組織PI3K蛋白和mRNA減少，Akt1蛋白和mRNA下降，提示山柰酚可以抑制PI3K/AKT1信號通路，炎癥和氧化應(yīng)激減輕，HAPE程度得到改善。說明山柰酚和PI3K/Akt信號通路之間存在相關(guān)性，山柰酚可以抑制PI3K/Akt信號通路，抑制高原低壓低氧引起的炎癥和氧化應(yīng)激，進而緩解HAPE。

綜上所述，山柰酚可以通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥預(yù)防急性高原肺水腫的發(fā)生，這種保護作用機制可能與PI3K/Akt信號通路抑制有關(guān)。