海馬高級糖基化終末產(chǎn)物受體和β-淀粉樣前體蛋白裂解酶表達增加與自發(fā)性高血壓大鼠認(rèn)知功能損害相關(guān)性研究

黃 冬，苗 銳，李 陽，郭 濤，張曉梅，楊榮軍，趙凱濤，梁軍麗，王 磊

(1.陜西省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西 西安710005;2.陜西省第二人民醫(yī)院急診科,陜西 西安710005)

高血壓，也稱為動脈血壓升高，表現(xiàn)為收縮壓大于140 mm Hg，舒張壓大于90 mm Hg，是一類廣泛的公共健康問題。在中國，其發(fā)病率逐年上升，在35～75歲的成年人中，將近一半的人均患有高血壓，其中只有不到三分之一的人接受了治療，不到十二分之一的人有效地控制了血壓數(shù)值[1]。目前，高血壓已經(jīng)成為首位導(dǎo)致人早逝的疾病，因為它常常會伴隨其他疾病產(chǎn)生，比如腦卒中、心衰等[2]。近些年發(fā)現(xiàn)高血壓與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的發(fā)生相關(guān)[3]。由于高血壓引起血管重構(gòu)，會導(dǎo)致一些心腦血管疾病和血管性癡呆，但是其中的機制尚不明確。

AD是癡呆最常見的一種類型，在全世界患病人數(shù)超過3.39千萬[4]。AD的最主要病變?yōu)榧毎夂ｑRβ淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)斑塊形成和細胞內(nèi)τ蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)[5]。癡呆引起的認(rèn)知功能障礙一般是認(rèn)為與海馬密切相關(guān)[6]。近些年海馬高級糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end-products,RAGE)被報道可以誘導(dǎo)高血壓動物腦中Aβ蛋白的沉積，造成認(rèn)知損害[7]。過量Aβ聚集是由Aβ前體蛋白(Amyloid-β precursor protein,APP)代謝異常而引起，在體內(nèi)，APP主要通過β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)清除，從循環(huán)血液中進入腦內(nèi)主要是通過RAGE介導(dǎo)[8]，因此RAGE與BACE1很有可能與自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous hypertension rats,SHR)認(rèn)知功能損害密切相關(guān)，本研究將通過在SHR模型上，探究海馬區(qū)RAGE與BACE表達變化與SHR認(rèn)知功能損害之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究所用動物為SHR與正常血壓大鼠(Normotensive wistar rats,NWR)。動物飼養(yǎng)在環(huán)境溫度與濕度均可控的實驗動物中心，環(huán)境照明為12 h明/暗。所有實驗均符合本院實驗動物管理條例。

1.2 實驗方法

1.2.1 NWR與SHR的增強型磁共振成像(MEMRI)[9]：用雙蒸水作為溶劑配置MnCl2溶液(Sigma Aldrich,USA)。在成像之前22 h，所有動物腹腔注射MnCl2溶液(70 mg/kg)，注射完后放回原籠子中飼養(yǎng)。在成像當(dāng)天，用3%～4%的異氟烷麻醉動物。采用4.7T的Magnex Scientific MR scanner進行成像拍攝，使用軟件為Agilent Technologies Vnmr J 3.1。

1.2.2 Morris水迷宮[10]：在圓形池加入添加有白粉的水，水溫保持在22～23 ℃。在第1～3天時，在水面有一略高出水面的平臺，將大鼠面向池壁，分別從四個入水點放入水中，重復(fù)3輪，記錄大鼠找到平臺的時間。在第4天時，隱藏平臺的位置，重復(fù)之前的操作，記錄大鼠在看不見平臺位置時，尋找到平臺的時間，考察大鼠對原平臺的記憶。

1.2.3 新事物識別:在進行新事物識別實驗前，每天撫摸實驗大鼠1 min，避免刺激大鼠。在進行實驗前24 h，將動物放在測試房間內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境。在訓(xùn)練階段，將兩個相同的物體放在同一側(cè)箱壁的左右兩端，將大鼠背朝兩物體且處于兩物體中線位置，靠近箱壁放入箱子中，放入后立即開啟錄像設(shè)備，實驗者離開測試房間。記錄時間持續(xù)5 min，記錄每一只大鼠與兩個相同物體分別接觸的時間。在測試階段，將其中一個物體換為另外一個新物體，同樣的方式，記錄每只大鼠在測試階段對舊物體與新物體分別的接觸時間。每只大鼠訓(xùn)練階段與測試階段間隔2 h。每換下一只大鼠前，將箱子與物體用酒精擦去氣味。測試結(jié)束后，將大鼠放回原來的飼養(yǎng)籠子中。

1.2.4 Western blot:將勻漿機置于冰上，預(yù)冷離心機，取出大鼠的全腦，在冰上分離海馬組織，用剪刀剪成小塊，稱取0.1 g組織，置于干凈的離心管中，加入1 ml RIPA裂解液(Beyotime,上海)裂解，電動勻漿機充分勻漿2～3 min，用離心機在4 ℃，12000 r/min離心15 min，取上清置于新的離心管中，進行超聲破碎。取5 μl樣品，用BCA試劑盒(Beyotime,上海)進行蛋白濃度測定。

將蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電壓設(shè)置100 V，時間90 min。濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，進行封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影和曝光等過程。

一抗包括：rabbit polyclonal anti-BACE1 (1∶1000;B0681,Sigma-Aldrich) ；mouse monoclonal anti-β-actin (1∶5000;A5316,Sigma-Aldrich)；rabbit polyclonal anti-RAGE antibody (1∶800;ab3611,Abcam)。

1.2.5 免疫蛋白反應(yīng):采用標(biāo)準(zhǔn)的ABC(Avidin-Biotin Complex)法對Aβ斑塊進行染色。所用一抗為mouse monoclonal anti-Aβ6E10(1∶1000;SIG-39300,Covance)。ABC法處理完成后，用DAB試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟進行后續(xù)染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 MEMRI數(shù)據(jù)處理按照已經(jīng)發(fā)表的實驗方法進行成像數(shù)據(jù)處理[11]。Morris水迷宮實驗和新事物識別實驗以及Western blot采用SPSS軟件(Version 20)，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SHR大鼠海馬在MEMRI中活動降低 在MEMRI的圖片中(圖1)，我們統(tǒng)計了NWR與SHR兩組大鼠海馬位置的信號強度(Signal intensity,SI)，發(fā)現(xiàn)SHR比NWR表現(xiàn)出較弱的核磁信號強度(0.698與1.499，P<0.01)，提示在SHR中，海馬腦區(qū)神經(jīng)元活動較低，海馬功能異常。

A、B：NWR與SHR大鼠MEMRI,紅線和箭頭指示位置為海馬腦區(qū)；C：A、B圖對應(yīng)腦圖譜位置；D：NWR與SHR大鼠海馬MEMRI核磁信號平均強度。*與NWR比較，P<0.01

2.2 SHR空間記憶能力下降 通過Morris水迷宮實驗，我們訓(xùn)練了SHR與NWR，在訓(xùn)練的第1天到第3天，SHR找到平臺的時間與NWR相比，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。在第4天的測試階段，SHR找到隱藏在水面下平臺的時間，比NWR要長(35.3與12.2，P<0.01)，提示SHR的空間記憶能力受損。見圖2。

A：NWR與SHR在迷宮中運動軌跡圖；B：NWR與SHR從入水點到達平臺所用的時間。*與NWR比較，P<0.01

2.3 SHR短期記憶能力受損 在新事物識別實驗的訓(xùn)練階段，SHR與NWR對兩個相同物體表現(xiàn)出類似的探索行為：對兩個物體的探索時間一樣，表明大鼠對左右沒有偏好性，同時NWR與SHR對兩個物體的探索時間長短沒有統(tǒng)計學(xué)差異。當(dāng)測試階段將其中一個舊物體更換為一個大鼠沒有見過的新物體，記錄每只大鼠對舊物體與新物體的探索時間，發(fā)現(xiàn)NWR與SHR對舊物體的探索時間相似，但是SHR對新物體的探索時間比NWR顯著降低(13.7與31.5，P<0.01)，提示SHR的短期記憶能力受損。見圖3。

A：訓(xùn)練階段以及測試階段示意圖；B：測試階段，NWR與SHR對舊事物與新事物的探索時間。*與NWR比較，P<0.01

2.4 RAGE在SHR海馬部位蛋白表達水平顯著升高 我們分離了大鼠的海馬腦區(qū)，并用Western blot 檢測了RAGE蛋白的變化。通過灰度對比檢測，我們發(fā)現(xiàn)SHR海馬部位的RAGE蛋白表達量相比NWR組顯著升高(0.407 與0.789，P<0.05)。見圖4。

A：RAGE蛋白與內(nèi)參Actin在海馬部位的Western blot條帶；B：RAGE的灰度值統(tǒng)計。*與NWR比較，P<0.05

2.5 BACE在SHR海馬部位蛋白表達水平顯著升高 我們還檢測了在海馬部位的BACE蛋白表達水平，在SHR的海馬腦區(qū)中，BACE蛋白的表達量相比NWR顯著增加(0.733 與 1.502,P<0.01)。見圖5。

A：BACE蛋白與內(nèi)參Actin在海馬部位的Western blot條帶；B：RAGE的灰度值統(tǒng)計。*與NWR比較，P<0.01

2.6 淀粉樣斑塊Aβ 在SHR海馬腦區(qū)中表達顯著增加 通過免疫蛋白反應(yīng)，我們對NWR與SHR的海馬切片進行染色，觀察到在NWR中，海馬腦區(qū)未觀察到Aβ陽性信號，而在SHR中，觀察到大量的淀粉樣棕色斑塊沉積，即為Aβ。見圖6。

A、B：NWR與SHR海馬腦區(qū)Aβ染色圖；C、D：分別對應(yīng)A、B中海馬腦區(qū)放大圖。A-B：標(biāo)尺=1 mm;C-D:標(biāo)尺=200 μm

3 討 論

目前全世界有三分之一的成年人都患有高血壓，在年齡超過65歲的人群中，其患病率可以達到三分之二[12-13]。未來2025年，患高血壓人數(shù)將可能增長到15.6億人。癡呆(Dementia)的患病率會隨著年齡的增長呈指數(shù)增加，65歲以上的人群，每5年，患病概率會加倍[14]。目前已有明確證據(jù)表明，高血壓會造成一系列腦疾病，包括認(rèn)知能力下降、阿爾茲海默病和血管性癡呆等[15-17]。在患有認(rèn)知功能障礙的人群中，大部分都患有高血壓[18]。但是目前對于高血壓中認(rèn)知功能是如何發(fā)生變化的，機制還沒有完全明確。因此亟須明確高血壓中，造成認(rèn)知功能改變的因素。

RAGE是一個多配體受體，其主要配體為糖化反應(yīng)終端產(chǎn)物(Glycation end products)，除此外，還能介導(dǎo)外周Aβ向腦內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程[19]。Aβ 的過量產(chǎn)生與沉積，是引起AD的主要原因之一，因此RAGE可能是通過影響Aβ 在腦內(nèi)的沉積過程，從而引起認(rèn)知功能的變化。BACE是一類跨膜蛋白，它可以通過水解APP蛋白而產(chǎn)生Aβ，在AD患者腦中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BACE的表達上調(diào)，臨床在研藥物包括BACE的抑制劑，可以通過抑制BACE活性，從而抑制Aβ的產(chǎn)生，對AD的發(fā)病進程產(chǎn)生影響[20]。BACE和RAGE均可以通過促進Aβ的產(chǎn)生，造成認(rèn)知功能損害。

我們通過自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)與正常血壓大鼠(NWR)，對高血壓中認(rèn)知功能發(fā)生改變的這一現(xiàn)象，進行了相關(guān)研究。通過MEMRI，我們觀察到SHR相比NWR，海馬區(qū)域腦活動降低，提示SHR的海馬功能受到抑制；通過水迷宮與新事物識別等行為學(xué)實驗，也觀察到SHR的空間記憶以及短期記憶能力降低，即認(rèn)知功能受損。進一步我們分別檢測了海馬區(qū)域RAGE與BACE的蛋白表達水平，在SHR中，兩種蛋白的表達水平均顯著升高，提示海馬區(qū)域功能降低、認(rèn)知功能受損可能是由于RAGE與BACE的表達量增加有關(guān)。我們又通過免疫蛋白反應(yīng)檢測了NWR與SHR的Aβ蛋白表達情況，在NWR中，我們幾乎沒有觀察到Aβ的表達，而在SHR中，海馬區(qū)域有大量淀粉樣的蛋白表達，即為Aβ的沉積。

本研究將為SHR中認(rèn)知功能變化的基礎(chǔ)研究與臨床研究提供理論基礎(chǔ)，但是在SHR中，海馬腦區(qū)的RAGE與BACE是如何增加的，還需要進行深入研究。