貝萊斯芽孢桿菌Pm9生物防治潛力及全基因組分析

李永麗， 周洲， 曲良建， 尹新明

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464006； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與森林保護(hù)研究所國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

生物防治(biological control)是利用有益生物及其產(chǎn)物控制有害生物種群數(shù)量的防治技術(shù)，常用于植物病蟲害的科學(xué)治理。近年來(lái)，芽孢桿菌在農(nóng)作物病蟲害防治方面起了重要作用。隨著對(duì)芽孢桿菌的研究不斷深入，不同種類芽孢桿菌也逐漸被分離鑒定出來(lái)。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌中新發(fā)現(xiàn)的1個(gè)種，最早于1999年被分離出來(lái)，2005年被首次報(bào)道和命名，普遍存在于自然界植物組織、土壤、河水以及海洋中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌中部分菌株抑菌譜廣，具有防治多種植物病害的潛力[2-3]，并且可以對(duì)植物產(chǎn)生防病、促生、固氮和抗逆境等作用，是重要的生防資源，其中部分菌株已經(jīng)成功用于植物病害生物防治[4-5]。獲得可以防治多種植物病害的內(nèi)生芽孢桿菌并進(jìn)一步研發(fā)制作生防制劑，這對(duì)植物病害生物防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。貝萊斯芽孢桿菌菌株P(guān)m9是從中國(guó)特有的樹(shù)種新疆野蘋果(Malussieversii)枝干中分離到內(nèi)生芽孢桿菌，該菌株對(duì)葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、蘋果擬莖點(diǎn)霉(Phomopsismali)蘋果3種致病菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)的拮抗作用，并且對(duì)蘋果樹(shù)無(wú)致病性，具有作為蘋果病害生防菌的應(yīng)用價(jià)值[6]，但菌株P(guān)m9是否具有更廣譜的抑菌作用還有待研究。此外，由于生防菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)在自然環(huán)境中大多不穩(wěn)定，導(dǎo)致生防菌的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用受到影響。生防菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)在施用到作物表面或者進(jìn)入到土壤時(shí)都要受到光照、溫度以及土壤酸堿性等影響。因此，生防菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)在多種環(huán)境條件下的穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)其是否具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的重要指標(biāo)[7-8]。由葡萄座腔菌引起的蘋果輪紋病會(huì)使果樹(shù)枝干枯死，削弱樹(shù)勢(shì)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致?tīng)€果，該病害在中國(guó)各蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，且近年來(lái)病情逐漸加重，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。葡萄座腔菌寄主范圍廣泛，除蘋果外還可危害楊樹(shù)等10多種樹(shù)木。菌株P(guān)m9對(duì)葡萄座腔菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抑制作用，但其抑制作用的具體表現(xiàn)還有待探查。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌能夠分泌多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中部分代謝產(chǎn)物具有抑菌和殺菌作用[1]。芽孢桿菌主要通過(guò) 2 種合成途徑產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，即由核糖體途徑合成的小分子物質(zhì)以及非核糖體途徑合成的多肽類抑菌物質(zhì)。核糖體合成肽類物質(zhì)如細(xì)菌素，而非核糖體合成途徑產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要有脂肽類化合物、聚酮類化合物和多肽類化合物等[1]。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)革新以及測(cè)序費(fèi)用的降低，越來(lái)越多的貝萊斯芽孢桿菌基因組序列被公布，這有助于解析貝萊斯芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑以及挖掘新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。基于上述原因，本研究以小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminis)、小麥紋枯病菌(Rizoctoniacerealis)、君子蘭莖基腐病菌(Fusariumproliferatum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和南天竹炭疽病菌(Colletotrichumkarstii)等常見(jiàn)的植物病原菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，探究菌株P(guān)m9的抑菌廣譜性，并對(duì)菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液在高溫、酸堿處理、紫外線照射和蛋白酶處理等條件下的抑菌活性穩(wěn)定性進(jìn)行分析，同時(shí)以葡萄座腔菌為靶標(biāo)菌，觀察了無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的作用，以期了解其抑菌作用，最后對(duì)該菌株P(guān)m9基因組進(jìn)行測(cè)序分析，挖掘其次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，從遺傳基礎(chǔ)上進(jìn)一步解析其生防作用的機(jī)制，以期為該菌株抑菌物質(zhì)研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 貝萊斯芽孢桿菌株P(guān)m9、葡萄座腔菌、小麥赤霉病菌、小麥全蝕病菌、小麥紋枯病菌、君子蘭莖基腐病菌、番茄灰霉病菌和南天竹炭疽病菌均由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院生物防治實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基配置按照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株P(guān)m9種子液制備 將菌株P(guān)m9單菌落接種于20 mL NA液體培養(yǎng)基中，于氣浴恒溫?fù)u床(常州國(guó)華CHA-S)中28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h備用。

1.2.2 菌株P(guān)m9對(duì)6種供試病原真菌的廣譜抑菌活性 將菌株P(guān)m9種子液按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種至NA液體培養(yǎng)基中，于氣浴恒溫?fù)u床(常州國(guó)華CHA-S)中28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液備用。供試病原菌為小麥赤霉病菌、小麥全蝕病菌、小麥紋枯病菌、君子蘭莖基腐病菌、番茄灰霉病菌和南天竹炭疽病菌。平板對(duì)峙試驗(yàn)和抑菌率計(jì)算參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.3 菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性試驗(yàn) 將菌株P(guān)m9按1.2.2步驟中獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)高速離心機(jī)(湘儀 H1850R)12 000 r·min-1離心20 min后，上清液用細(xì)菌過(guò)濾器(濾膜孔徑0.22 μm)過(guò)濾，即得無(wú)菌發(fā)酵濾液。無(wú)菌發(fā)酵濾液經(jīng)以下4種方法處理。熱處理： pH值為7的無(wú)菌發(fā)酵濾液于60、80、100和121 ℃處理30 min后自然冷卻，121 ℃為常規(guī)高壓滅菌的溫度，對(duì)照為28 ℃未經(jīng)高溫處理的無(wú)菌發(fā)酵濾液。酸堿處理：用移液器吸取1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH滴加到發(fā)酵濾液中，將10 mL無(wú)菌發(fā)酵濾液pH值調(diào)整至3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，4 ℃靜置12 h后調(diào)至pH值為7。蛋白酶K處理：pH值為7的無(wú)菌發(fā)酵濾液中加入蛋白酶K(上海生工)，至終質(zhì)量濃度為100 mg·L-1，37 ℃水浴60 min。紫外線處理：將pH值為7的無(wú)菌發(fā)酵濾液在紫外燈(PHILIPS TUV 15 W)距離30 cm處放置，照射15、30、45、60和120 min。將5 mL不同處理過(guò)后的無(wú)菌發(fā)酵濾液與45 mL PDA培養(yǎng)基混勻后制成平板，以葡萄座腔菌為待測(cè)試菌，按照李永麗等[6]的方法計(jì)算抑菌率并進(jìn)行對(duì)比。

1.2.4 無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)葡萄座腔菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的影響 將葡萄座腔菌分生孢子加入菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液與等體積的體積分?jǐn)?shù)2% 葡萄糖混合溶液中，制成孢子懸浮液，將孢子懸浮液滴于凹玻片中，對(duì)照組為體積分?jǐn)?shù)1%葡萄糖中的孢子懸浮液，在28 ℃、培養(yǎng)12 h后觀察孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次。菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)葡萄座腔菌菌絲生長(zhǎng)影響試驗(yàn)方法同1.2.3，分別挑取含有無(wú)菌發(fā)酵濾液的平板和對(duì)照中的菌絲制成玻片，顯微鏡 (蔡司，Primostar 3)觀察菌絲形態(tài)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 應(yīng)用軟件SPSS 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較、鄧肯(Duncan)方法進(jìn)行樣本間差異顯著性分析，用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

1.2.6 菌株P(guān)m9全基因組測(cè)定分析 將純化的菌株P(guān)m9提取DNA經(jīng)3代Nanopore測(cè)序儀進(jìn)行全基因組測(cè)序(北京，百邁克生物科技有限公司)。采用Prodigal軟件進(jìn)行編碼基因預(yù)測(cè)，利用預(yù)測(cè)得到的基因序列與蛋白相鄰類的聚簇(clusters of orthologous groups, COG)、京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)、Swiss-Prot、TrEMBL、非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant protein sequence database, Nr)等功能數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST比對(duì)，進(jìn)行基因功能注釋[11]?；贜r數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，應(yīng)用軟件Blast2GO進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋[11]。利用軟件hmmer基于Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Pfam功能注釋，同時(shí)進(jìn)行COG、KEGG代謝通路富集分析、GO功能富集分析等基因功能注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān)m9對(duì)6種病原真菌的拮抗作用

菌株P(guān)m9對(duì)6種病原菌的拮抗作用如圖1所示，抑菌率均在55.0%以上。菌株P(guān)m9對(duì)小麥全蝕病菌抑菌率為87.5%，拮抗作用最強(qiáng)；對(duì)小麥赤霉病菌抑菌率為55.5%，拮抗作用較弱。對(duì)南天竹炭疽病菌、小麥紋枯病菌、番茄赤霉病菌和君子蘭葉腐病菌的抑菌率分別為72.8%、68.3%、66.7%和58.3%。

圖1 菌株 Pm9對(duì)6種植物病原菌平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The test results of antagonism of the strain Pm9 to 6 plant diseases

2.2 菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液中抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性

2.2.1 熱處理對(duì)菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響 如圖2所示，菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液在60 ℃處理后，抑菌活性與對(duì)照無(wú)顯著差異，抑菌率為97.0%；溫度升至80 ℃時(shí)，抑菌活性稍微降低，但抑菌率仍超過(guò)80.0%；當(dāng)溫度升高至100、121 ℃時(shí)，抑菌率分別為66.9%和58.8%。菌株P(guān)m9抑菌物質(zhì)在80 ℃以下時(shí)具有較好的穩(wěn)定性。

注：不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。下同。Note：Different lowercase letters represent significant differences(P<0.05).The same as below.圖2 熱處理對(duì)菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響Fig.2 Effect of different temperature treatment on the antifungal activity of fermentation broth of strain Pm9

2.2.2 紫外線對(duì)菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響 如圖3所示，經(jīng)紫外線照射一定時(shí)間后，菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性沒(méi)有減弱。試驗(yàn)中照射120 min后，菌株P(guān)m9抑菌率還保持在96.0%以上，與未經(jīng)照射之前處于同一水平，這說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)對(duì)紫外線不敏感。

圖3 紫外線對(duì)菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of ultraviolet light on the antifungal activity of fermentation broth of strain Pm9

2.2.3 酸堿處理對(duì)菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響 菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液經(jīng)不同pH條件處理后，抑菌率見(jiàn)圖4。pH值在4～10時(shí)，菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液保持了原有的抑菌活性，抑菌率均在90.0%以上；當(dāng)pH值為3和11時(shí)，抑菌率仍可達(dá)到75.1%和70.2%；當(dāng)pH值為12時(shí)，抑菌率顯著下降。這說(shuō)明該菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌物質(zhì)在pH值4～10范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性。

圖4 酸堿處理對(duì)菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of pH treatment on the antifungal activity of fermentation broth of strain Pm9

2.2.4 蛋白酶K處理對(duì)菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響 菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液經(jīng)蛋白酶K水浴處理60 min后抑菌率為90.4%，無(wú)菌發(fā)酵濾液處理前抑菌率為92.5%，抑菌活性處于同一水平?jīng)]有顯著性差異。菌株P(guān)m9抑菌活性不受蛋白酶K影響，說(shuō)明無(wú)菌發(fā)酵濾液中抑菌活性物質(zhì)不是蛋白質(zhì)。

2.3 菌株P(guān)m9對(duì)葡萄座腔菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的作用

葡萄座腔菌分生孢子培養(yǎng)12 h后正常萌發(fā)(圖5-A)，菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液能夠抑制其孢子的萌發(fā)，有的孢子一端產(chǎn)生泡囊(圖5-B)，未見(jiàn)芽管生長(zhǎng)，分生孢子萌發(fā)抑制率達(dá)100%。葡萄座腔菌正常條件下菌絲是線性的(圖5-C)，當(dāng)培養(yǎng)基中添加無(wú)菌發(fā)酵濾液后，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，菌絲形態(tài)發(fā)現(xiàn)扭曲變形，產(chǎn)生泡囊結(jié)構(gòu)(圖5-D)。

注：A. 對(duì)照孢子萌發(fā)； B. Pm9無(wú)菌發(fā)酵濾液處理的孢子； C. 對(duì)照菌絲； D. Pm9無(wú)菌發(fā)酵濾液處理的菌絲。Note：A. Normal spores germination in the control； B. The effect of fermentation broth of strain Pm9 on spores； C. Normal hyphal growth in the control； D. The effect of fermentation broth of strain Pm9 on hyphal morphology.圖5 菌株P(guān)m9對(duì)葡萄座腔菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of strain Pm9 on spore germination and mycelial morpholopy of B. berengeriana

2.4 菌株P(guān)m9全基因組分析

菌株P(guān)m9經(jīng)測(cè)序組裝，其基因組為1個(gè)完整環(huán)狀染色體，全長(zhǎng)為3 890 670 bp，GC含量為46.66%，編碼3 771個(gè)基因，平均長(zhǎng)度為901 bp，編碼序列占整個(gè)基因組序列的87.37%。全基因組在GenBank的登錄號(hào)為CP059855。統(tǒng)計(jì)COG注釋分類結(jié)果見(jiàn)圖6。菌株P(guān)m9共有2 904個(gè)基因獲得注釋，其中參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(N)的有347個(gè)、轉(zhuǎn)錄(B)的有289個(gè)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(M)的有254個(gè)、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(R)的有208個(gè)，另外參與次生代謝產(chǎn)物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝(S)的有200個(gè)、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換(L)的有175個(gè)、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/胞外被膜生物合成(H)的有174個(gè)，而參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成(A)的有160個(gè)。

注： A.翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成； B.轉(zhuǎn)錄； C.復(fù)制、重組和修復(fù)；D.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)； E.細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂 染色體分配； F.防御機(jī)制；G.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；H.細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/胞外被膜生物合成；I. 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；J.胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；K.翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶； L.能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換； M.碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝； N.氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝； O.核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝； P.輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝； Q. 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝； R.無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝； S.次生代謝產(chǎn)物生物合成、 轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝； T.一般功能預(yù)測(cè)； U.未知。Note： A.Translation, ribosomal structure and biogenesis； B.Transcription； C.Replication, recombination and repair；D.Chromatin structure and dynamics； E.Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning； F.Defense mechanisms；G.Signal transduction mechanisms；H.Cell wall/membrane/envelope biogenesis；I.Cell motility；J.Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport；K.Posttranslational modification, protein turnover, chaperones； L.Energy production and conversion； M.Carbohydrate transport and metabolism； N.Amino acid transport and metabolism； O.Nucleotide transport and metabolism； P.Coenzyme transport and metabolism； Q.Lipid transport and metabolism； R.Inorganic ion transport and metabolism； S.Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism； T.General function prediction only； U.Function unknown.圖6 貝萊斯芽孢桿菌Pm9 COG功能注釋分類統(tǒng)計(jì)Fig.6 Function classification and percentage of strain Bacillus velezensis Pm9 genome genes according to COG database

經(jīng)COG功能富集分析、KEGG代謝通路富集分析、GO功能富集分析等數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST比對(duì)后，有99.4%的基因得到功能注釋。菌株P(guān)m9具有合成地非西丁(difficidin)、豐原素(fengycin)、bacillibactin、表面活性素(surfactin)、subtilin、iturins、bacillaene、macrolactin、bacilysin等多種肽聚糖和聚酮糖類化合物的基因，染色體上存在位置見(jiàn)圖7。這些抗菌脂肽類物質(zhì)是病害防治的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。GO注釋分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，菌株P(guān)m9可產(chǎn)生分解病原菌細(xì)胞壁的纖維素酶(GE03528)、β-1,3-葡聚糖酶(GE01743、GE03528)和幾丁質(zhì)酶(GE01542)基因；誘導(dǎo)抗病性相關(guān)的脂多糖(GE02186、GE01507、GE00119)、水楊酸(GE03623、GE03096)、乙酰乳酸脫羧酶(GE02029)和乙酰乳酸合酶(GE02782、GE02028、GE02781)基因；也可產(chǎn)生抗逆性相關(guān)的亞精胺合成酶基因(GE01887)和海藻糖運(yùn)輸?shù)鞍?GE00858、GE00856、GE00857)基因。這些基因產(chǎn)物對(duì)保護(hù)自身機(jī)體、抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)、誘導(dǎo)和增加植物抗病性方面具有作用。

注： 從外向內(nèi)分別代表：基因組正鏈的基因；基因組負(fù)鏈上的基因(不同顏色代表不同的COG功能分類)；預(yù)測(cè)次生代謝產(chǎn)物的位置； tRNA和rRNA(藍(lán)色為tRNA，紫色是rRNA)；GC含量；GC-偏移。Note： From the outer circle to the center: CDS on forward strand (colored according to COG categories), CDS on reverse strand, locations of predictive secondary metabolite, tRNA and rRNA (tRNA in blue, rRNA in purple), GC content and GC skew.圖7 貝萊斯芽孢桿菌Pm9基因組環(huán)形圖Fig.7 Circular map of Bacillus velezensis strain Pm9 genome

3 結(jié)論與討論

本研究中貝萊斯芽孢桿菌Pm9來(lái)自中國(guó)特有樹(shù)種新疆野蘋果，該菌株對(duì)蘋果輪紋病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，且本研究結(jié)果表明，菌株P(guān)m9對(duì)小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、小麥全蝕病菌、番茄灰霉病菌、南天竹炭疽病菌和君子蘭莖基腐病菌等植物病原菌具有較好的抑制作用，證實(shí)了菌株P(guān)m9的抗菌廣譜性，拓展了該菌株未來(lái)潛在的應(yīng)用范圍。

貝萊斯芽孢桿菌菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線、溫度、酸堿處理后的抑菌活性發(fā)生變化，說(shuō)明該菌株抑菌活性會(huì)受到外界環(huán)境條件的影響。趙雅等[12]報(bào)道貝萊斯芽孢桿菌HN-Q-8菌株經(jīng)紫外線照射35 min，抑菌率下降到74%，抑菌活性物質(zhì)不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿，適宜pH值為4～10。本研究中菌株P(guān)m9無(wú)菌發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線照射120 min抑菌率依然維持在96%以上；經(jīng)pH值為3和11酸堿處理后，抑菌率仍可達(dá)75.1%和70.2%。這表明菌株P(guān)m9活性成分耐紫外線照射和酸堿的能力強(qiáng)，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。對(duì)不同理化條件全基因組分析表明，菌株P(guān)m9含有亞精胺合成酶和海藻糖運(yùn)輸?shù)鞍谆?。亞精胺具有保護(hù)機(jī)體耐受高鹽、低溫和低濕的功能[13]，海藻糖具有極強(qiáng)的防紫外線、耐熱性和耐酸性等優(yōu)良特性[14]。菌株P(guān)m9還具有合成多種抗菌脂肽類物質(zhì)，如地非西丁(difficidin)、豐原素(fengycin)、bacillibactin、表面活性素(surfactin)

等能力，這些抗菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性，對(duì)紫外照射不敏感，對(duì)蛋白酶K等多種蛋白酶不敏感。這些結(jié)果一定程度上從遺傳學(xué)角度解釋了菌株P(guān)m9抑菌物質(zhì)活性穩(wěn)定性高的原因。貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要有葡聚糖酶[15]、脂肽類物質(zhì)[16-17]等。本研究全基因組序列結(jié)果顯示，菌株P(guān)m9具有可產(chǎn)生多種抗菌脂肽類物質(zhì)的基因簇，以及纖維素酶[18]、β-1,3-葡聚糖酶[19]和幾丁質(zhì)酶[20]合成相關(guān)的基因。脂肽類物質(zhì)iturin主要通過(guò)影響真菌細(xì)胞膜的表面張力，導(dǎo)致微孔的形成、促使電解質(zhì)及其他重要離子的滲漏而表現(xiàn)出強(qiáng)的抗真菌活性。纖維素酶、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶是分解病原菌細(xì)胞壁的酶類，并且β-1,3-葡聚糖酶對(duì)真菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有抑制作用[21-22]。本研究結(jié)果不僅解釋了菌株P(guān)m9可抑制多種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)和葡萄座腔菌孢子萌發(fā)的原因，而且還發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)m9可通過(guò)產(chǎn)生抗生物質(zhì)和水解酶類來(lái)實(shí)現(xiàn)病害的防治。此外，全基因組分析結(jié)果顯示，菌株P(guān)m9含有脂多糖[23]、水楊酸[24]、乙酰乳酸脫羧酶[25]和乙酰乳酸合成酶[26]等與誘導(dǎo)植物抗性相關(guān)的基因，表明菌株P(guān)m9還可通過(guò)誘導(dǎo)植物抗性防治植物病害。不同的貝萊斯芽孢桿菌菌株基因組組成有一定差異，比如有的菌株含有質(zhì)粒[26]，而本研究中Pm9菌株沒(méi)有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒存在。

研究表明，貝萊斯芽孢桿菌菌株P(guān)m9對(duì)蘋果輪紋病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果擬莖點(diǎn)霉具有很強(qiáng)的拮抗作用[6]。本研究進(jìn)一步明確了該菌株還對(duì)小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、小麥全蝕病菌、番茄灰霉病菌、南天竹炭疽病菌等植物病原菌表現(xiàn)出抑菌廣譜性，拓寬了該菌株潛在的應(yīng)用范圍。全基因組分析表明，菌株P(guān)m9的防病作用可通過(guò)產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)、水解酶類和誘導(dǎo)植物抗病性等得以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)還解釋了菌株P(guān)m9抑菌活性成分對(duì)環(huán)境因子具有更強(qiáng)適應(yīng)性的遺傳基礎(chǔ)。貝萊斯芽孢桿菌菌株P(guān)m9被證明具有多種植物病害防治的優(yōu)良特性。