三葉青2個ThBLH轉(zhuǎn)錄因子cDNA的克隆及其對光質(zhì)與光周期信號的響應(yīng)

聞靜， 劉俊， 段華平， 林國衛(wèi)， 蔡紅， 張莉， 趙剛

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334000；2.上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西 上饒 334000)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)是中國特有珍貴藥用植物，中醫(yī)記述三葉青可治療小兒高熱驚厥、肺炎、哮喘、肝炎以及風(fēng)濕等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三葉青塊根提取物在治療腫瘤等方面具有良好效果[2-3]，對于乳腺癌[4]、腸癌[5]、食道癌[6]等癌癥中的癌細(xì)胞增殖、遷移、生長都有不同程度抑制作用。隨著三葉青藥用功能的深入挖掘，其經(jīng)濟(jì)價值逐漸被市場認(rèn)同。江西省是三葉青重要的產(chǎn)地及栽培地之一[7]，江西省懷玉山三葉青被農(nóng)業(yè)部核準(zhǔn)為地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品。因此，進(jìn)一步認(rèn)識三葉青塊根發(fā)育的相關(guān)分子生物學(xué)基礎(chǔ)，特別是環(huán)境光信號所參與的塊根發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制對于三葉青的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培具有指導(dǎo)意義。

相關(guān)研究表明，環(huán)境光信號所參與的塊根發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制是由BEL1-like同源結(jié)構(gòu)(BEL1-like homeodomain，BLH)轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的，植物的BLH基因與BELL基因家族屬于同源基因，是植物體內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子[8]，調(diào)控植物的發(fā)育中許多生物學(xué)過程[9]，如分生組織的形成及分生特性的保持[10]、蘋果心皮及果實的發(fā)育[11]、營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段的轉(zhuǎn)變[12]等。BLH基因所編碼的蛋白屬于TALE(three amino acid loop extension)蛋白家族，具有2個保守域，其中1個結(jié)合DNA的同源結(jié)構(gòu)域(homeodomain)，在該區(qū)域有1個保守SKY保守盒；另外1個是與同源盒蛋白(knotted1-like homebox，KNOX)相互作用的BELL保守域(或POX superfamily)，包括1個保守的VSLTLGL基元[13]。該基因家族編碼的蛋白與KNOTTED1-type 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成異質(zhì)蛋白二聚體，結(jié)合目的基因5’-UTR區(qū)的TTGAC-TTGAC序列，啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄[14]。

光質(zhì)及光周期是影響植物的生長重要環(huán)境信號[15]。HOANG等[16]研究表明，不同起源的地下儲藏器官的發(fā)育受到相似的分子網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。目前，光周期調(diào)控植物地下儲藏器官發(fā)育主要集中于模式植物馬鈴薯，馬鈴薯的光周期誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，StBEL5位于塊莖形成信號分子網(wǎng)絡(luò)的上游，可誘導(dǎo)匍匐莖內(nèi)源激素代謝及運輸相關(guān)的基因表達(dá)，甚至還包括塊莖形成的移動信號分子StCDF1及StSP6A的表達(dá)從而促進(jìn)塊莖的形成[17]，因此推測三葉青的BLH轉(zhuǎn)錄因子有可能在塊根發(fā)育過程中起到一定作用。聞靜等[18]研究表明，長日光周期有利于塊根的形成與發(fā)育，藍(lán)光及紅光補(bǔ)充光照可顯著提高三葉青塊根的產(chǎn)量。本研究從三葉青塊根發(fā)育不同時期(纖維根、初始膨大塊根、膨大塊根)的轉(zhuǎn)錄組中篩選出相對表達(dá)量顯著提高的2個ThBLH基因cDNA，通過PCR方法成功進(jìn)行分離，通過相對熒光定量表達(dá)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)方法進(jìn)一步分析這2個cDNA在塊根發(fā)育不同時期的表達(dá)特征，以及在不同光周期與光質(zhì)處理下的表達(dá)模式，從而篩選出積極響應(yīng)的ThBLH轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步梳理光質(zhì)及光周期所調(diào)控的三葉青塊根發(fā)育的分子通路提供分子水平參考基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 三葉青品種為懷玉2號，由上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。

1.1.2 試劑與儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover、熒光定量試劑盒THUNDERBIRD?Next SYBR qPCR Mix購自(上海)東洋紡生物公司；RNA提取試劑盒Quik RNA Isolation KitGK購自北京華越洋生物科技公司；PCR試劑2×TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix I 購自北京全式金生物公司；膠回收試劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0及克隆載體pMDTM18-T Vector Cloning Kit均購自寶生物工程 (大連) 有限公司(大連TaKaRa公司)；其他試劑購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

引物合成服務(wù)由上海生物工程股份有限公司提供，測序服務(wù)由上海尼桑生物科技有限公司提供。PCR擴(kuò)增儀(AG 22331，德國艾本德Eppendorf)；熒光定量PCR儀(TL988-IV型，西安天隆科技有限公司)；電泳儀(PowerPac Basic，美國伯樂Bio-Rad)；RNA核酸定量檢測儀(Biospec Nano，日本島津)；燈架及各種波段LED燈購自徐州愛佳電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法 以2018-07-25種植的1 a生懷玉2號扦插苗為材料，于江西省上饒市五府山三葉青種植基地設(shè)施大棚(118°4′14″ N，28°0′53″ E)及上饒師范學(xué)院生態(tài)園區(qū)的日光溫室內(nèi)種植。

光質(zhì)試驗處理：自2019-08-20開始持續(xù)處理45 d，每天18：00后分別以440～445 nm的藍(lán)光、625～630 nm 的紅光及白光(混合光，CK)照射3 h。具體參考聞靜等[18]光質(zhì)處理方法。

光周期處理：于2020-09-18起在上饒師范學(xué)院生態(tài)園日光溫室的植物培養(yǎng)箱中進(jìn)行，從8：00開始光暗循環(huán)。培養(yǎng)箱內(nèi)光照處理時間控制條件分為4種：CK，光照(light，L)12 h +黑暗(dark，D)12 h；短日照處理(SD)，L 8 h+ D 16 h；長日照處理(LD)，L16 h+D 8 h；CO：連續(xù)24 h光照。光周期馴化3 d，于2020-09-21的12：00開始采樣，每隔4 h采樣1次，至2020-09-22的8：00結(jié)束取樣；暗期采樣在黑暗中具有遮光設(shè)施的天平上進(jìn)行。取3～5株葉片剪碎混合，進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)，用錫紙包好并標(biāo)記后放入液氮速凍10 min，于-80 ℃冰箱保存用于RNA提取。

塊根發(fā)育不同時期：觀察時間為2020-12-22，分別取未形成塊根的植株纖維根(Ⅰ期)、初始膨大的塊根(Ⅱ期)、膨大塊根(Ⅲ期)及具有塊根植株的纖維根(Ⅳ期)，發(fā)育狀態(tài)如圖1所示。每個處理取4～5株樣品，清洗后吸干表面水分，剪碎混合后立即取100 mg，進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)，用錫紙包好并標(biāo)記后放入液氮速凍10 min，于-80 ℃冰箱保存用于RNA提取。

注：Ⅰ，未形成塊根的植株纖維根；Ⅱ，初始膨大的塊根；Ⅲ，膨大塊根；Ⅳ，具有塊根植株的纖維根，紅框內(nèi)是纖維根。Note：Ⅰ. The fibrous roots of plant without tuber；Ⅱ. Initially expanded tuber；Ⅲ. Expanded tuber；Ⅳ. The fibrous roots of plant with tuber， and in the red box are the fibrous roots.圖1 三葉青塊根發(fā)育不同時期情況Fig.1 The different stages of root tuber development of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 參照提取試劑盒說明書提取三葉青葉片及塊根總RNA。在進(jìn)行RNA的純度及定量檢測后，選取A為260/280 ≥1.8、260/230 ≥1.5的總RNA用于cDNA合成，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書取120 ng的總RNA用于反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 三葉青ThBLH轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析 利用 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中的在線開放讀碼框預(yù)測軟件ORF finder 程序預(yù)測ThBLH基因的開放閱讀框，并獲得相應(yīng)推測的氨基酸序列；NCBI數(shù)據(jù)庫的pblast程序在線與其他物種進(jìn)行同源性比對分析，利用Conserved domains 模塊預(yù)測推測蛋白序列的名稱與保守域；采用在線多重比對工具Clustalw(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)進(jìn)行推測蛋白質(zhì)序列的多重比較；采用Mega7.0軟件進(jìn)行多重序列比對及進(jìn)化樹的構(gòu)建(neighbor joining)。

1.2.4 三葉青ThBLH轉(zhuǎn)錄因子cDNA的克隆和測序 根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組獲得的unigene 序列，以轉(zhuǎn)錄組相對表達(dá)量差異分析結(jié)果為依據(jù)，篩選在塊根發(fā)育不同時期顯著差異表達(dá)且相對表達(dá)量較高的ThBLH轉(zhuǎn)錄因子，并經(jīng)過初步生物信息學(xué)分析后具有典型的BLH轉(zhuǎn)錄因子保守域的cDNA序列作為目的克隆基因。利用primer3-SGD在線引物設(shè)計軟件(https://www.yeastgenome.org/primer)設(shè)計2個ThBLH轉(zhuǎn)錄因子全長擴(kuò)增引物，如表1所示。參照說明書進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為50 μL，共35個循環(huán)，反應(yīng)條件為98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min。PCR 產(chǎn)物以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖TAE凝膠電泳檢測。將純化后的PCR產(chǎn)物與載體PMD-18T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽性克隆進(jìn)行測序。

1.2.5 定量qRT-PCR分析 根據(jù)三葉青轉(zhuǎn)錄組中的ThBLH轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列，利用引物設(shè)計軟件primerplus3(http://www.primer3plus.com/)設(shè)計特異擴(kuò)增ThBLH的熒光定量引物，如表1所示。反應(yīng)操作參照試劑盒說明書，反應(yīng)體系調(diào)整為20 μL。塊根發(fā)育不同時期內(nèi)參基因選用18S rRNA，光周期內(nèi)參基因選用ELF-α(MT731970)、TUBA(MT731969)及18S rRNA(MW296875)，不同光質(zhì)內(nèi)參基因選用18S rRNA、TBP(MT731974)及TUBA，引物序列參照聞靜等[18]所設(shè)計的熒光定量引物，內(nèi)參Ct值取這3個基因的幾何平均值。試驗設(shè)置生物學(xué)重復(fù)、技術(shù)重復(fù)各3次。相對熒光定量數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法[19]，顯著性分析采用SPSS軟件的LSD法分析，利用字母法標(biāo)注。

表1 用于ThBLH轉(zhuǎn)錄因子CDS克隆及相對熒光定量分析的引物序列Table 1 Primers sequences used for ThBLH transcription factors CDS cloning and relative fluorescence quantitative analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青ThBLH轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的 ORF finder 程序分析(表2)顯示，ThBLH1開放讀碼框長度為2 166 bp，編碼721個氨基酸，ThBLH2開放讀碼框長度2 100 bp，編碼699個氨基酸；保守域分析表明2個ThBLH的cDNA編碼的推測蛋白序列都含有POX及Homeobox KN保守域；預(yù)測的蛋白分類為BLH蛋白，主要參與生物學(xué)過程為轉(zhuǎn)錄調(diào)控；在2個推測的ThBLH蛋白在N端具有保守的的SKY BOX及C端的VSLTLGL BOX，這些都是BELL家族成員典型的保守結(jié)構(gòu)，各保守域及保守氨基酸序列具體位置見圖2；進(jìn)化樹分析(圖3)表明，ThBEL1蛋白與銀白楊(Poppulusalba)、毛果楊(Populustrichocarpa)及錦葵(Herraniaumbratica)的BLH蛋白 1親緣進(jìn)化關(guān)系最近，ThBEL2蛋白與河岸葡萄(Vitisriparia)BLH蛋白 1處于同一進(jìn)化分支。

表2 ThBLH1及ThBLH2轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatics analysis of ThBLH1 and ThBLH2 transcription factors

注：藍(lán)色標(biāo)注的氨基酸序列為POX結(jié)構(gòu)域，標(biāo)注紅框的為SKY盒；紫色標(biāo)注的氨基酸序列為同源結(jié)構(gòu)域(Homeobox KN)；綠色并標(biāo)注紅框的為VSLTLGL盒；*表示相同氨基酸序列。Note：Amino acids marked with blue is POX domain，red box shows SKY box；Amino acids marked with purple is Homeobox KN；Amino acids marked with blue and in the red box is VSLTLGL box; *shows the same amino acid.圖2 ThBLH1及ThBLH2蛋白質(zhì)序列多重比較及保守域分析Fig.2 Multiple alignment and conserved domain analysis of ThBLH1 and ThBLH2 protein sequence

注：標(biāo)尺表示遺傳進(jìn)化距離；黑色圓點表示三葉青的ThBLH序列；括號中的內(nèi)容代表蛋白序列ID。Note：The bar shows the evolutionary distance; The black circle indicates the ThBLH sequence. The content in the brackets represents the protein sequence ID numbers.圖3 ThBLH1及ThBLH2蛋白進(jìn)化樹的構(gòu)建Fig.3 Phylogenetic tree construction of ThBLH1 and ThBLH2

2.2 三葉青ThBLH基因克隆

對轉(zhuǎn)錄因子ThBLH基因的cDNA序列擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示(圖4)，ThBLH1(2 401 bp)、ThBLH2(2 299 bp)擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期接近。測序得到的堿基序列與前期獲得的轉(zhuǎn)錄組序列堿基差異較小，通過特異引物克隆得到的ThBLH序列與轉(zhuǎn)錄組中cDNA序列一致性在99.99%以上。

注：M： DL5000 Maker； 1：ThBLH1擴(kuò)增片段；2：ThBLH2擴(kuò)增片段。Note: M: DL5000 Maker; 1: The Amplified fragment of ThBLH1 2: The Amplified fragment of ThBLH2.圖4 PCR方法擴(kuò)增ThBLH1(A)與ThBLH2(B)基因的產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 The agarose electrophoresis of amplifying ThBLH1 (A)and ThBLH2(B) by PCR

2.3 三葉青塊根發(fā)育不同時期ThBLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式分析

ThBLH1表達(dá)分析表明(圖5)，在三葉青塊根Ⅲ期中ThBLH1相對表達(dá)量最高且與Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅳ期呈顯著差異，Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅳ期間該基因相對表達(dá)量差異不顯著；ThBLH2相對表達(dá)量從低到高依次為Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅰ期及Ⅳ期，其中在Ⅱ期及Ⅲ期間差異不顯著，Ⅱ期相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ期及Ⅳ期，但Ⅱ期相對表達(dá)量差異與Ⅲ期不顯著，Ⅳ期中該基因相對表達(dá)量顯著低于其他時期。上述分析表明三葉青塊根中(塊根及初始膨大塊根)ThBLH1與ThBLH2基因相對表達(dá)量顯著高于纖維根。

注：Ⅰ，不具有塊根的植株的纖維根；Ⅱ，初始膨大的塊根；Ⅲ，塊根；Ⅳ，具有塊根植株的纖維根；顯著性水平P<0.05。Note：Ⅰ. The fibrous roots of plant without tuber；Ⅱ. Initially expanded tuber；Ⅲ. Tuber；Ⅳ. The fibrous roots of plant with tuber; The significance level was P<0.05.圖5 三葉青塊根發(fā)育不同時期ThBLH1(A)與ThBLH2(B)基因的相對表達(dá)量Fig.5 The relative expression of ThBLH1(A)and ThBLH2(B)in different development stage of root tuber

2.4 不同光周期處理下ThBLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式分析

不同光周期處理下ThBLH1的不同時間點的表達(dá)分析表明(圖6-A)，除次日8:00以外，SD處理下該基因相對表達(dá)量顯著高于LD、CO處理及CK，而在次日8:00時SD處理下該基因相對表達(dá)量顯著高于CO處理及CK但與LD差異不顯著。ThBLH2在不同光周期處理下表達(dá)特征表明(圖6-B)，SD處理下ThBLH2基因相對表達(dá)量在20:00—次日8:00顯著高于CK，在12:00時其相對表達(dá)量與LD及CO差別不顯著，在20:00時與CO差別不顯著但顯著高于LD；在次日0:00—次日4:00時CO相對表達(dá)量顯著提高且顯著高于其他處理，其他處理間則差異不顯著。不同光周期處理中CK及LD處理下ThBLH1在各時間點呈低水平表達(dá)，而ThBLH2在SD及CO處理分別在20:00及次日4:00有表達(dá)高峰。

注：顯著性水平P<0.05。Note：The significance level was P<0.05.圖6 不同光周期處理下ThBLH1(A)與ThBLH2(B)基因的相對表達(dá)量Fig.6 The relative expression of ThBLH1(A) and ThBLH2(B) under different photoperiods treatments

2.5 不同光質(zhì)補(bǔ)充光照處理下ThBLH1及ThBLH2在葉片及塊根中的表達(dá)特征

為了研究ThBLH1及ThBLH2對光質(zhì)信號的響應(yīng)，對不同光質(zhì)處理下葉片及塊根中2個ThBLH基因相對表達(dá)量進(jìn)行了分析。如圖7所示，在紅光處理下葉片中ThBLH1相對表達(dá)量最高且顯著高于其他平行其他光質(zhì)處理，白光處理下ThBLH1相對表達(dá)量與CK無顯著差異但顯著高于藍(lán)光，藍(lán)光處理下該基因相對表達(dá)量與CK無顯著差異；而塊根中藍(lán)光處理下ThBLH1相對表達(dá)量顯著低于其他處理，其他3個處理間表達(dá)差異不顯著。對不同光質(zhì)處理下ThBLH2相對表達(dá)量分析表明，葉片中該基因相對表達(dá)量在各光質(zhì)處理間差異不顯著，塊根中白光處理下該基因相對表達(dá)量顯著高于其他處理，其他處理間相對表達(dá)量差異不顯著。無論葉片還是塊根中藍(lán)光處理后ThBLH1相對表達(dá)量較低，而ThBLH2相對表達(dá)量只有在塊根中白光處理后顯著高于其他處理，其他處理間無差異。

注：A.不同光質(zhì)處理下ThBLH1及ThBLH2在葉片中相對表達(dá)量；B.不同光質(zhì)處理下ThBLH1及ThBLH2在塊根中相對表達(dá)量；CK.對照;BL.藍(lán)光處理；RL.紅光處理;WL.白光處理；顯著性水平P<0.05。Note：A. Expression of ThBLH1 and ThBLH2 in leaves under different light quality treatment conditions；B. Expression of ThBLH1 and ThBLH2 in tuber under different light quality treatment conditions； CK. control; BL. blue light treatment; RL.red light treatment; WL, white light treatment； The significance level was P<0.05.圖7 不同光質(zhì)補(bǔ)充光照處理下ThBLH1及ThBLH2在葉片及塊根中的表達(dá)特征Fig.7 The expression profiles of ThBLH1 and ThBLH2 under different light quality illumination supplement

3 結(jié)論與討論

本研究中克隆的2個ThBLH的cDNA推測的蛋白保守域分析表明，ThBLH1與ThBLH2蛋白都具有POX domain及Homeodomain保守序列，POX domain的功能還是未知的，而Homeodomain KN是與DNA結(jié)合的主要位點，ThBLH是DNA結(jié)合蛋白[20]。目前，關(guān)于光周期與BELL基因家族在地下儲藏器官中關(guān)系的研究僅限于馬鈴薯，其中，發(fā)現(xiàn)3個與塊莖形成相關(guān)的StBEL基因，StBEL5對馬鈴薯塊莖的形成具有促進(jìn)作用，而StBEL11及StBEL29對塊莖的形成及生長起到抑制作用[21]。另外，馬鈴薯的StBEL5及其Knox蛋白伴侶POTH1，通過調(diào)控激素水平從而介導(dǎo)匍匐莖中塊根的形成[22]。而本研究中的ThBLH與StBEL基因?qū)儆谕唇Y(jié)構(gòu)基因，相對表達(dá)量分析表明ThBLH1在塊根中的表達(dá)水平顯著高于其他塊根發(fā)育時期，而ThBLH2的表達(dá)水平在塊根的初始膨大期及顯著高于纖維根狀態(tài)，說明ThBLH基因可能在塊根形成中起到一定作用，這與馬鈴薯的情況類似。LIU等[23]研究表明，擬南芥的AtBLH6特異的與KNAT7組成復(fù)合蛋白通過調(diào)控擬南芥木質(zhì)素合成基因的表達(dá)參與到次級細(xì)胞壁的建成中，從而對擬南芥的生長起到促進(jìn)作用。但這2個ThBLH基因在三葉青塊根發(fā)育中的具體功能還未明確，需要通過基因功能驗證試驗進(jìn)一步證實。

模式植物馬鈴薯的StBEL5基因的研究表明，其5’UTR的啟動子區(qū)具有大量的保守的光反應(yīng)原件如GT1、GATA和AT1基元[24]，推測該類轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)受光的調(diào)控。本研究團(tuán)隊前期的測產(chǎn)研究表明，短日處理下三葉青塊根產(chǎn)量的最低[18]，而在本研究結(jié)果中短日處理下葉片中ThBLH1相對表達(dá)量在顯著高于其他處理，這與光周期所調(diào)控塊根產(chǎn)量形成呈負(fù)相關(guān)性，因此該基因在光周期所調(diào)控的三葉青塊根膨大中的功能還需要進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因試驗證實。

目前，BLH類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與光質(zhì)之間研究較少，光周期所介導(dǎo)的StBEL5的轉(zhuǎn)錄水平被白光及紅光促進(jìn)[25]。本研究顯示，葉片中紅光處理下ThBLH1相對表達(dá)量最高，而白光顯著提高了ThBLH2在塊根中相對表達(dá)量，與以上研究結(jié)果類似。本研究中藍(lán)光處理下可顯著抑制ThBLH1基因在葉片及塊根中的表達(dá)。前期測產(chǎn)實驗表明藍(lán)光和紅光補(bǔ)充光照都可以提高三葉青塊根產(chǎn)量[18]，而藍(lán)光處理下ThBLH1基因相對表達(dá)量與塊根產(chǎn)量表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。

本研究中ThBLH類轉(zhuǎn)錄因子相對表達(dá)量與塊根膨大呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)趨勢，但在光周期及光質(zhì)處理下該轉(zhuǎn)錄因子相對表達(dá)量與塊根產(chǎn)量增加呈負(fù)相關(guān)趨勢。由于本研究只對該基因在塊根發(fā)育不同階段、不同光周期處理及光質(zhì)處理下ThBLH1與ThBLH2相對表達(dá)量進(jìn)行了分析，很難直接判斷該基因與塊根膨大的相關(guān)性。植物地下儲藏器官發(fā)育過程是復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中不僅包括淀粉、糖的積累，還包括許多次生代謝產(chǎn)物如黃酮類化合物、乙酸乙酯、酚酸類化合物等次生代謝產(chǎn)物[26]，而ThBLH類轉(zhuǎn)錄因子又是植物體內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，其受光信號調(diào)控及如何作用于下游相關(guān)分子通路的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果通過初步明確了ThBLH1及ThBLH2的生物學(xué)信息學(xué)特征，并分析了光質(zhì)及光周期信號對這2個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響，為進(jìn)一步認(rèn)識ThBLH轉(zhuǎn)錄因子在塊根發(fā)育中的生物學(xué)功能提供了初步的分子生物學(xué)參考。