冬小麥對(duì)不同鎘濃度的響應(yīng)及鎘吸收和亞細(xì)胞分布特點(diǎn)研究

秦世玉，劉紅恩，梅浩，李艷行，高巍，聶兆君，李暢，趙鵬

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/河南省土壤污染防控與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

鎘(Cd)是植物生長(zhǎng)非必需且具有較強(qiáng)毒害的元素，在植物體內(nèi)積累到一定濃度后對(duì)不同組織和器官引起毒害癥狀，進(jìn)而抑制植物生長(zhǎng)和發(fā)育。研究表明，植物受到鎘毒害后一般會(huì)引起根系活力降低、植物體內(nèi)氧化還原失衡、光合作用降低，從而抑制植物根系生長(zhǎng)與礦質(zhì)元素的吸收，致使葉片發(fā)黃縮卷等生長(zhǎng)不良癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致植物死亡[1]。植物自身具有一些列調(diào)節(jié)措施可降低鎘毒害。通過(guò)根系分泌物降低根際鎘活性，減少根系對(duì)鎘的吸收，降低根系鎘向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，與細(xì)胞液中的植物螯合素或金屬硫蛋白絡(luò)合將更多的鎘區(qū)室化到液泡部位，提高抗氧化物酶活性來(lái)清除鎘脅迫產(chǎn)生的活性氧(超氧化物陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫)，這些植物對(duì)鎘的響應(yīng)也是緩解鎘毒害的主要機(jī)制[2-3]。

到目前為止，越來(lái)越多的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因被發(fā)現(xiàn)。鎘從土壤轉(zhuǎn)運(yùn)到作物子粒包括根部吸收、不同亞細(xì)胞儲(chǔ)存、木質(zhì)部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)、地上部鎘遷移到子粒等幾個(gè)關(guān)鍵步驟，而不同的過(guò)程均有相關(guān)的基因參與[4]。例如OsNramp5和HvNramp5參與根系對(duì)鎘的吸收[5-6]。OsHMA3參與根系細(xì)胞中鎘向液泡中的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]，OsHMA2則參與調(diào)控鎘在木質(zhì)部裝載向地上部運(yùn)輸[8-9]，另外OsZIP7和OsCAL1也參與鎘向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)[10-11]。OsHMA2、OsLCT1、OsZIP7和OsCCX2參與了地上部鎘向子粒的遷移[11-14]。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)小麥種植區(qū)域土壤重金屬鎘含量超標(biāo)嚴(yán)重，同時(shí)引起小麥子粒鎘含量超標(biāo)現(xiàn)象也較為嚴(yán)重[15-16]。苗期鎘吸收與成熟期子粒鎘積累具有顯著的正相關(guān)性關(guān)系[17]，且前期研究發(fā)現(xiàn)，污染土壤上冬小麥在整個(gè)生育期都存在鎘吸收的情況，且子粒鎘含量很容易超過(guò)食品中鎘限量標(biāo)準(zhǔn)(0.1 mg·kg-1，GB 2762—2005)。因此，本研究以苗期小麥為材料，通過(guò)不同鎘濃度脅迫探究冬小麥生長(zhǎng)、鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和亞細(xì)胞分布，以期探明冬小麥對(duì)鎘的吸收分布特征。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)供試冬小麥品種為百農(nóng)207。選取飽滿均勻一致的種子，1% NaClO消毒15 min，然后用去離子水洗凈后均勻擺放到育苗盤(pán)(長(zhǎng)×寬×高:29 cm×24 cm×6 cm)。避光催芽，育苗7 d后，挑選10株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗轉(zhuǎn)移到含營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)盤(pán)(長(zhǎng)×寬×高:22 cm×14 cm×7 cm)中培養(yǎng)，光照培養(yǎng)室參數(shù)為溫度(25±2)℃，濕度75%，光強(qiáng)度180 μmol·m-2·s-1，光/暗時(shí)間14/8 h。營(yíng)養(yǎng)液濃度為：4.0 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，6.0 mmol·L-1KNO3，1 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O，2.0 mmol·L-1MgSO4·7H2O，100 μmol·L-1EDTA-Fe，46.2 μmol·L-1H3BO3，9.1 μmol·L-1MnCl2·4H2O，0.3 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.8 μmol·L-1ZnSO4·7H2O 和0.2 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O。1/2營(yíng)養(yǎng)液濃度培養(yǎng)第一周，隨后全營(yíng)養(yǎng)液濃度培養(yǎng)，并設(shè)置0、5、50 μmol·L-13個(gè)Cd濃度，Cd源為CdCl2·2.5H2O。試驗(yàn)所涉及試劑均為分析純和去離子水。每個(gè)處理4次重復(fù)，4 d換1次營(yíng)養(yǎng)液。脅迫生長(zhǎng)至23 d，分根系和地上部收獲小麥幼苗，測(cè)定生理指標(biāo)和鎘元素含量。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 根系形態(tài)測(cè)定 根系形態(tài)參數(shù)包括總根長(zhǎng)、總根系表面積、平均直徑、總根系體積、總根尖數(shù)，測(cè)定方法參考秦世玉等[18]，具體步驟如下：取收獲小麥幼苗1株，用干凈剪刀減掉根系，然后將根系浸泡到裝有去離子水的三角瓶中。用根系掃描儀(WinRHIZO 2009,Canada)對(duì)根系掃描成像，ImageJ軟件分析計(jì)算總根長(zhǎng)、總根系表面積、平均直徑、總根系體積、總根尖數(shù)。

1.2.2 葉綠素含量測(cè)定 葉綠素含量測(cè)定參考李合生等[19]的方法，具體步驟：取小麥新鮮葉片樣品，剪碎混勻后稱取0.25 g，共3份，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇25 mL避光室溫浸提48 h。用紫外分光光度計(jì)(TU-1901，北京，中國(guó))測(cè)定過(guò)濾液在波長(zhǎng)665、649和470 nm下吸光度。

1.2.3 光合參數(shù)測(cè)定 樣品收獲前用便攜式光合測(cè)定儀(Li-6400P,Li-Cor,USA)測(cè)定凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間二氧化碳濃度(Ci)等光合參數(shù)。光合測(cè)定儀采用LED光源，并進(jìn)行光源矯正，光強(qiáng)設(shè)置為飽和光強(qiáng)度(約為1 200 μmol·m-2·s-1)，重復(fù)2次取平均值。

1.2.4 鎘的亞細(xì)胞分布 細(xì)胞壁、細(xì)胞器和細(xì)胞液組分通過(guò)差速離心法進(jìn)行分離：稱新鮮葉片1 g，放入預(yù)冷的研缽中，加入12 mL緩沖液，研磨成勻漿后用高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5810 R,德國(guó))2 057×g離心10 min，沉淀物為細(xì)胞壁及細(xì)胞壁組分。上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管后12 857×g離心50 min，沉淀物為細(xì)胞器組分，上清液為胞液。緩沖液組分為：250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1tris-HCl (pH 7.5)、1 mml·L-1MgCl2和10 mmol·L-1半胱氨酸。所有操作在低溫條件下進(jìn)行。

1.2.5 Cd 含量測(cè)定 將一部分鮮樣105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至質(zhì)量恒定，粉碎干樣后稱取0.100 0 g左右樣品。亞細(xì)胞組分電爐烘至微干。所有樣品均加入5 mL HNO3-HClO4混酸(4∶1,v/v)進(jìn)行消化。消煮完全后過(guò)濾定容，原子吸收分光光度計(jì)(ZEEnit 700; Analytik Jena AG,Germany)測(cè)定樣品Cd 含量。Cd遷移系數(shù)=地上部Cd含量(mg·kg-1)/根部鎘含量(mg·kg-1)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 20.0(IBM,SPSS Statisitcs,V20.0)軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，處理間比較采用單因素方差分析，各處理平均數(shù)采用最小顯著差數(shù)(LSD)法在0.05顯著水平下進(jìn)行多重比較。SigmaPlot 12.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鎘處理對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響

如圖所示，從形態(tài)上可以看出鎘處理顯著抑制冬小麥根和地上部的長(zhǎng)度(圖1-a，b)。從生物量積累情況可以看出，相對(duì)于Cd0處理，Cd5和Cd50處理小麥鮮重分布降低了40.19%和67.29%(圖1-c)，小麥干物質(zhì)重分別降低29.31%和51.65%(圖1-d)。另外，相對(duì)于Cd0處理，Cd5和Cd50處理顯著降低了小麥的單株含水量，降低幅度分別為2.23%和5.80%(圖1-e)。說(shuō)明鎘抑制了冬小麥生物量的積累，且高濃度鎘抑制更顯著。

注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note:Different letters indicate the significant differences among treatments(P<0.05).The same as below.圖1 不同鎘處理下冬小麥生長(zhǎng)狀況(a)、鮮質(zhì)量(b)、干質(zhì)量(c)和含水量(d)Fig.1 The growth status (a),fresh weight (b),dry weight (c) and water content (d) of winter wheat under different Cd treatments

2.2 不同濃度鎘處理對(duì)小麥根系生長(zhǎng)的影響

通過(guò)分析根系形態(tài)參數(shù)同樣發(fā)現(xiàn)，鎘顯著影響到根系發(fā)育，且高濃度鎘影響更顯著(圖2)。相對(duì)于不施鎘處理(Cd0)，Cd5和Cd50處理下總根長(zhǎng)分別減少27.82%(P<0.05)和70.19%(P<0.05)；總根表面積分別降低23.27%和64.23%(P<0.05)；根直徑分別增加4.59%和15.68%(P<0.05)；根體積分別減少18.82%和57.16%(P<0.05)；根尖數(shù)分別減少53.60%(P<0.05)和67.83%(P<0.05)(表1)。說(shuō)明施鎘通過(guò)降低根系伸長(zhǎng)、增粗及側(cè)根生長(zhǎng)進(jìn)而影響根系發(fā)育。

圖2 不同濃度鎘處理?xiàng)l件下根系掃描圖像(a，不施鎘；b，Cd5處理；c，Cd50處理)Fig.2 The root scanning images under different Cd concentrations (a,without Cd; b,Cd5 treatment; c,Cd50 treatment)

表1 不同濃度鎘處理?xiàng)l件下根系參數(shù)Table 1 The root parameters under different Cd concentrations

2.3 不同濃度鎘處理對(duì)小麥葉片葉綠素含量和光合參數(shù)的影響

不同濃度鎘對(duì)葉片色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素及總?cè)~綠素含量)含量及光合參數(shù)(光合速度、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度、蒸騰速率)的影響如表2，結(jié)果顯示相對(duì)于不施鎘處理，施鎘對(duì)色素含量及光合參數(shù)(蒸騰速率除外)沒(méi)有顯著影響。然而隨鎘濃度增加葉綠素a、葉綠素b含量呈增加趨勢(shì)，且總?cè)~綠素含量在Cd50處理下具有最大值。另外，蒸騰速率也隨著鎘溶度增高而顯著提高，Cd5和Cd50處理下提高幅度分別為27.52%和25.06%。色素含量及光合蒸騰速率的增加可能是緩解鎘毒害的生理響應(yīng)。

表2 不同鎘濃度處理?xiàng)l件下葉片色素含量和光合參數(shù)Table 2 The leaf pigment concentrations and photosynthetic parameters under different Cd concentrations

2.4 不同鎘濃度處理對(duì)小麥鎘含量的影響

隨著鎘濃度的增加，冬小麥根系和地上部鎘含量均呈增加趨勢(shì)(圖3)。Cd5和Cd50處理?xiàng)l件下根部鎘含量分別為786.23和1 294.33 mg·kg-1，地上部鎘含量分別為94.6和211.0 mg·kg-1。說(shuō)明冬小麥隨著鎘處理濃度的提高而增加對(duì)鎘的吸收，且根部具有更高的鎘積累。進(jìn)一步分析鎘在小麥中的遷移系數(shù)發(fā)現(xiàn)，Cd5和Cd50處理?xiàng)l件下鎘的遷移系數(shù)分別為0.122和0.161，說(shuō)明隨著鎘濃度的增加提高了鎘在小麥體內(nèi)的遷移，而低的遷移系數(shù)同樣也說(shuō)明了鎘在小麥體內(nèi)具有低的向地上部遷移能力。

圖3 不同鎘處理?xiàng)l件下根部鎘含量(a)、地上部鎘含量(b)和遷移系數(shù)(c)Fig.3 Cadmium concentrations in root (a),shoot (b) and migration coefficient (c) under different Cd treatments

2.5 不同鎘濃度處理對(duì)小麥鎘的亞細(xì)胞分布的影響

不同亞細(xì)胞組分鎘含量如圖4。結(jié)果表明，隨著鎘濃度的增加根系和地上部不同亞細(xì)胞組分鎘含量均呈增加趨勢(shì)。Cd5和Cd50處理?xiàng)l件下地上部細(xì)胞壁組分鎘含量分別為47.03和92.79 mg·kg-1，細(xì)胞器組分鎘含量分別為7.58和13.54 mg·kg-1，細(xì)胞液組分鎘含量分別為114.18和246.13 mg·kg-1； Cd5和Cd50處理?xiàng)l件下根部細(xì)胞壁組分鎘含量分別為172.58和321.05 mg·kg-1，細(xì)胞器組分鎘含量分別為38.88和44.63 mg·kg-1，細(xì)胞液組分鎘含量分別為732.7和1 209.42 mg·kg-1。不同亞細(xì)胞組分鎘含量數(shù)據(jù)表明鎘含量分布具有以下趨勢(shì)：根部>地上部，可溶性組分>細(xì)胞壁組分>細(xì)胞器組分。

圖4 不同鎘處理?xiàng)l件下地上部亞細(xì)胞組分鎘含量(a細(xì)胞壁組分、b細(xì)胞器組分、c可溶性組分)和根部亞細(xì)胞組分鎘含量(d細(xì)胞壁組分、e細(xì)胞器組分、f可溶性組分)Fig.4 The Cd concentrations of subcellular components (a cell wall component,b organelle component,c soluble component) in shoot and root (d cell wall component,e organelle component,fsoluble component) under different Cd treatments

進(jìn)一步分析不同亞細(xì)胞組分鎘含量比例，同樣可以發(fā)現(xiàn)具有可溶組分>細(xì)胞壁組分>細(xì)胞器組分的趨勢(shì)(圖5)。在根部，隨著鎘濃度的增加細(xì)胞壁組分鎘含量顯著增加，細(xì)胞液組分和細(xì)胞器組分鎘含量呈下降趨勢(shì)。而鎘濃度的增加對(duì)地上部不同細(xì)胞器組分鎘含量比例影響不大。

圖5 不同鎘處理?xiàng)l件下地上部(A)和根部(B)亞細(xì)胞組分鎘含量比例Fig.5 The percentage of Cd concentration in subcellular components of shoot (A) and root (B) under different Cd treatments

3 討論

3.1 鎘對(duì)冬小麥生長(zhǎng)的影響

鎘是毒性較強(qiáng)的元素，植物吸收鎘危害植物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)。其中干物質(zhì)積累量是植物光合作用和營(yíng)養(yǎng)吸收等生長(zhǎng)的綜合體現(xiàn)，也是產(chǎn)量高低的養(yǎng)分庫(kù)。本研究中相對(duì)于Cd0，Cd5和C50處理下鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和含水率均顯著降低，且高濃度處理降低幅度更大，說(shuō)明鎘作為植物毒害元素抑制植物干物質(zhì)的積累和水分吸收。根系作為植物吸收營(yíng)養(yǎng)元素的器官，同時(shí)也是吸收重金屬的主要部位。因此，根系參數(shù)的變化也說(shuō)明了鎘對(duì)植物的脅迫程度。本研究發(fā)現(xiàn)施鎘抑制小麥總根長(zhǎng)、總根表面積、根體積和根尖數(shù)，增加了根系直徑。表明施鎘通過(guò)降低根系伸長(zhǎng)、增粗及側(cè)根生長(zhǎng)進(jìn)而影響根系發(fā)育。研究表明，鎘對(duì)根系的毒害主要是鎘脅迫后產(chǎn)生的過(guò)氧化物對(duì)根細(xì)胞核仁產(chǎn)生毒害，抑制核糖核酸酶的活性，改變RNA合成等途徑抑制根系伸長(zhǎng)，使根系細(xì)胞老化[20]。而根直徑的增加可能與Cd處理可誘導(dǎo)小麥幼苗根系皮層細(xì)胞增多、薄壁細(xì)胞增大以及內(nèi)皮層細(xì)胞壁木質(zhì)素的沉積有關(guān)[21]。另外，研究發(fā)現(xiàn)鎘處理可顯著降低水稻幼苗光合作用，且隨鎘濃度增加水稻幼苗凈光合速率(Pn),氣孔導(dǎo)度(Gs),蒸騰速率(Tr),氣孔限制值(Ls)逐步下降[22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)鎘脅迫有提高冬小麥光合素色及光合參數(shù)的趨勢(shì)，但沒(méi)有達(dá)到顯著水平，這可能與不同作物對(duì)鎘的耐性和生理響應(yīng)存在差異有一定關(guān)系。

3.2 冬小麥鎘吸收分布特征分析

一般條件下，小麥體內(nèi)鎘含量隨根系環(huán)境鎘含量增高而增高，不同器官具有不同的鎘貯存能力，小麥各部位鎘富集系數(shù)大小順序?yàn)楦?葉>莖>子粒[22-23]。本研究中植物體內(nèi)鎘含量隨處理鎘濃度增高而增高。其中根部鎘濃度在Cd50處理下高達(dá)1 294.33 mg·kg-1，是地上部鎘含量(211.0 mg·kg-1)的6倍多。說(shuō)明冬小麥在鎘吸收過(guò)程中將更多的鎘截留在根部，降低鎘向地上部的遷移。進(jìn)一步分析Cd5和Cd50處理?xiàng)l件下鎘的遷移系數(shù)也發(fā)現(xiàn)，在小麥中鎘具有較低的遷移系數(shù)(分別為0.122和0.161)。李樂(lè)樂(lè)等[23]對(duì)47個(gè)冬小麥品種鎘吸收分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)介于0.10～0.60之間。說(shuō)明冬小麥對(duì)鎘的遷移與品種有一定的關(guān)系，也可能與根系細(xì)胞細(xì)胞壁阻控和液泡貯存及根系向木質(zhì)部裝載有關(guān)[24-25]。進(jìn)一步分析不同亞細(xì)胞組分鎘含量及鎘積累量比例發(fā)現(xiàn)，鎘濃度的增加對(duì)地上部不同細(xì)胞器組分鎘含量比例影響不大，根系和地上部不同亞細(xì)胞組分鎘含量都隨鎘處理濃度增加而增加，且不同亞細(xì)胞組分鎘含量數(shù)據(jù)可以看出根部>地上部，可溶性組分>細(xì)胞壁組分>細(xì)胞器組分。細(xì)胞壁作為鎘進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)的第一道屏障，且細(xì)胞壁富含親鎘物質(zhì)和陽(yáng)離子交換位點(diǎn)，使鎘能夠固定在細(xì)胞壁上。鎘在液泡的貯存能夠防止細(xì)胞質(zhì)中過(guò)多的鎘對(duì)植物細(xì)胞器官造成損害，同時(shí)也可以防止鎘向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此細(xì)胞壁組分對(duì)鎘的吸附和液泡對(duì)鎘的貯存可有效降低鎘對(duì)植物生長(zhǎng)的傷害，也是降低冬小麥子粒鎘積累的有效措施[26]。

4 結(jié)論

鎘顯著抑制生物量和根系參數(shù)的生長(zhǎng)，且高濃度鎘抑制效果更明顯。不同部位鎘含量分析表明冬小麥大量鎘阻控在根系，降低鎘向地上部的遷移，減輕鎘對(duì)地上部的毒害及向子粒的富集。不同亞細(xì)胞組分鎘含量分析發(fā)現(xiàn)小麥吸收更多的鎘分布在可溶性組分(液泡部位)和細(xì)胞壁組分，通過(guò)將鎘合理的區(qū)室化進(jìn)而降低鎘對(duì)細(xì)胞器官的傷害?？傊?，鎘作為重金屬對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生脅迫效應(yīng)，而植物則可以通過(guò)優(yōu)化鎘的吸收和分配來(lái)降低毒害效應(yīng)。