均化在淫羊藿飲片質(zhì)量均一性控制中的應(yīng)用

薛 原 吳 梅 王優(yōu)杰 馮 怡 劉敏臣 張繼全

上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203

中藥飲片的質(zhì)量均一是保證制劑批間質(zhì)量穩(wěn)定的前提[1]。由于飲片質(zhì)量受產(chǎn)地、基原、采收期等多種因素影響，批次間常存在較大質(zhì)量差異，若以此為原料進(jìn)行生產(chǎn)，質(zhì)量波動(dòng)勢必傳導(dǎo)至產(chǎn)品中，導(dǎo)致制劑批間質(zhì)量均一性難以得到保證[2-3]。均化技術(shù)作為提高物料均一性的方法，已被運(yùn)用于白酒勾調(diào)[4]、煙草加工[5]、水泥生產(chǎn)[6-7]等方面。為解決原料質(zhì)量波動(dòng)導(dǎo)致的制劑批間質(zhì)量差異問題，國家藥品審評中心于2020 年11 月發(fā)布了《中藥均化研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》，旨在使用均化操作提高中藥制劑批間質(zhì)量均一性[8]。

淫羊藿是多基原藥材，種屬復(fù)雜多樣[9-10]。研究表明，淫羊藿飲片的批間質(zhì)量差異明顯[9-10]，這給制劑生產(chǎn)原料的選擇及成品的質(zhì)量穩(wěn)定性控制帶來了巨大挑戰(zhàn)[11-12]。本研究以淫羊藿飲片為均化對象，以指標(biāo)成分朝藿定C、淫羊藿苷的含量為基礎(chǔ)設(shè)定均化目標(biāo)，使用均化軟件確定均化比例，對不同批次飲片進(jìn)行均化，從指標(biāo)成分含量及指紋圖譜相似度的角度對均化結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，以期探索一種簡單穩(wěn)定的方法來提高中藥飲片的質(zhì)量均一性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XP-205 型十萬分之一電子分析天平、FA-2104 N 型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SKT-210 HP 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

朝藿定C 對照品（批號：PS 000213，中國食品藥品檢定研究院）；淫羊藿苷對照品（批號：110737-201516，中國食品藥品檢定研究院）；水為超純水；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

7 批淫羊藿飲片經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院倪梁紅老師鑒定，均為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.的干燥葉，飲片相關(guān)信息見表1。

表1 飲片相關(guān)信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成濃度分別為1.16、0.98 mg/ml 的單一對照品母液。取1 ml 母液定容至25 ml 量瓶中，稀釋得46.39、39.04 μg/ml 的單一對照品溶液，備用。

精密稱取朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成濃度分別為2.02、1.86 mg/ml 的混合對照品母液。取1 ml 母液定容至50 ml 量瓶中，稀釋得40.38、37.23 μg/ml 的混合對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

取淫羊藿粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 ml，稱重，超聲處理（功率400 W，頻率50 kHz）1 h，放冷，再次稱重，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定條件

2.3.1 指標(biāo)成分含量測定色譜條件 色譜柱：Grace Apollo C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸水溶液（26∶74）；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl；檢測波長：270 nm。

2.3.2 指紋圖譜色譜條件 色譜柱：Pntulips QS C18Plus 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫為0～35 min，26%A；35～55 min，26%～40%A；55～75 min，40%～55%A；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl；檢測波長：270 nm。

2.4 確定均化比例

將均化前飲片的含量測定結(jié)果采用均化軟件進(jìn)行計(jì)算[13-14]，以7 批淫羊藿飲片中朝藿定C、淫羊藿苷平均含量的120%為均化目標(biāo)，設(shè)定目標(biāo)值朝藿定C為0.85%、淫羊藿苷為0.84%，計(jì)算最優(yōu)均化比例，得到6 批均化后飲片。均化比例見表2。

表2 飲片均化比例

2.5 方法學(xué)考察結(jié)果

2.5.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μl，按“2.3.1”項(xiàng)下條件測定，朝藿定C、淫羊藿苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度均＞1.5，拖尾因子均為0.95～1.05，淫羊藿苷理論塔板數(shù)＞8000。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系 取“2.1”項(xiàng)下對照品溶液，加適量甲醇稀釋得濃度為0.04、0.08、0.20、0.40、1.01、2.02 mg/ml的朝藿定C 對照品溶液；加適量甲醇稀釋得濃度為0.04、0.07、0.19、0.37、0.93、1.86 mg/ml 的淫羊藿苷對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下測定。以朝藿定C、淫羊藿苷進(jìn)樣質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表3。結(jié)果顯示，指標(biāo)成分在一定質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表3 淫羊藿中指標(biāo)成分的線性關(guān)系考察

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10 μl，按“2.3.1”項(xiàng)下連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果朝藿定C 為0.32%、淫羊藿苷為0.34%，提示儀器的精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S7 批供試品，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.3.1”項(xiàng)下測定。計(jì)算峰面積RSD，結(jié)果樣品中朝藿定C 為0.85%、淫羊藿苷為0.26%，提示供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取S7 批供試品，按“2.2”項(xiàng)下制備6 份供試品溶液，分別吸取10 μl，按“2.3.1”項(xiàng)下測定。計(jì)算峰面積RSD，結(jié)果測得朝藿定C 為1.73%、淫羊藿苷為1.27%，提示該方法重現(xiàn)性良好。

2.5.6 加樣回收率 精密稱定已知含量的S7 批供試品6 份，每份約0.1 g，分別加入一定量的對照品，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下測定，計(jì)算朝藿定C、淫羊藿苷的平均回收率分別為99.75%、97.66%，RSD 分別為3.37%、4.33%，結(jié)果見表4～5。提示本方法回收率良好。

表4 朝藿定C 加樣回收率結(jié)果（n=6）

表5 淫羊藿苷加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.6 均化前后含量測定結(jié)果

以“1.2”項(xiàng)下7 批淫羊藿飲片作為均化前原料，以“2.4”項(xiàng)下得到的6 批為均化后原料，供試品溶液按“2.3.1”項(xiàng)下測定。計(jì)算得均化前后各成分含量及RSD，結(jié)果見表6～7。通過均化能使不同批次的淫羊藿飲片中朝藿定C、淫羊藿苷含量的RSD 明顯降低，提示批間質(zhì)量差異減小，均一性提高。

表6 均化前后朝藿定C 含量及RSD（%）

表7 均化前后淫羊藿苷含量及RSD（%）

2.7 指紋圖譜研究結(jié)果

供試品溶液按“2.3.2”項(xiàng)下測定，采用《中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A 版》進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[15-16]。設(shè)定S1 批為參照圖譜，多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，得到對照指紋圖譜及10 個(gè)共有特征峰。均化前后淫羊藿飲片的指紋圖譜及對照圖譜見圖2～4，進(jìn)一步計(jì)算得均化前后相似度結(jié)果見表8。均化前后淫羊藿飲片的相似度得以明顯提高，提示不同批次質(zhì)量基本達(dá)到均一穩(wěn)定。

表8 均化前后飲片指紋圖譜相似度及RSD

圖2 淫羊藿飲片對照指紋圖譜

3 討論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)地不同批次的淫羊藿飲片質(zhì)量差異較大，分析可能是受到土壤條件[17]、生長年限[18]、采收期[19]、產(chǎn)地加工方式[20]、炮制方法[21]等多種因素影響。不同產(chǎn)地的淫羊藿原料中，甘肅產(chǎn)地的飲片質(zhì)量相對較為優(yōu)良，合格率高[22-23]。

圖3 均化前飲片指紋圖譜

圖4 均化后飲片指紋圖譜

此外，淫羊藿中多糖類也為主要成分，若將其納入考慮指標(biāo)將更全面地反映淫羊藿飲片質(zhì)量，但目前尚缺乏簡單精確、誤差小的測定方法，故本研究未將其作為均化評價(jià)指標(biāo)[24]。同時(shí)，僅用相似度評價(jià)或許不能完全反映飲片質(zhì)量及批次間的相似程度，在未來研究中還可以考慮納入更多的指標(biāo)，如峰面積、共有峰個(gè)數(shù)、峰面積和等[25]。

本研究方法中均化比例的確定借助軟件，操作簡單且精確度高，適合用于工業(yè)生產(chǎn)，值得推廣。