雙胎妊娠合并胎兒染色體異常的產(chǎn)前診斷方法*

鄭嬌 宋婷婷 徐盈 李佳 楊紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

雙胎妊娠屬于高危妊娠，雙胎圍產(chǎn)期并發(fā)癥較單胎明顯增加，在為雙胞胎異常妊娠的父母提供咨詢時，相關(guān)的早產(chǎn)風險是一個重要因素，因為雙胞胎異常分娩時的平均孕周為35.7周[1]。雙胞胎的先天性異常差異很大，可能影響一個或多個器官系統(tǒng)，且雙胎尤其是異卵雙胎的血清學(xué)篩查及無創(chuàng)檢查結(jié)果不能準確表明胎兒的體征情況，故雙胎介入性產(chǎn)前診斷的需求日益增加。本研究回顧性分析來我院進行遺傳咨詢的353例雙胎妊娠孕婦，分析其介入性產(chǎn)前診斷指征和染色體結(jié)果以及染色體異常胎兒的妊娠結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究選取2014年1月～2020年8月來我院進行產(chǎn)前診斷的雙胎孕婦共353例，產(chǎn)前診斷孕周為18～33周。經(jīng)產(chǎn)前遺傳咨詢，孕婦及家屬簽署知情同意書后，進行羊水穿刺術(shù)及胎兒染色體核型分析。

1.2 羊膜腔穿刺 羊水樣本采集經(jīng)B超引導(dǎo)定位，在無菌條件下，采用羊水專用穿刺針經(jīng)腹部穿刺，抽取30 mL羊水，其中15 mL用于羊水細胞培養(yǎng)進行后續(xù)染色體G顯帶分析，另外15 mL進行染色體微陣列芯片檢查。

1.3 染色體G顯帶核型分析 將新鮮抽取的羊水轉(zhuǎn)入15 mL無菌離心管1500 r/min離心5 min，去上清留沉淀，分別接種于兩個培養(yǎng)瓶中，加入羊水細胞培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。由于羊水細胞生長方式為貼壁生長，5～7天后換液一次，一般培養(yǎng)8～10天后，待形成密集的細胞克隆6個以上后收獲細胞。棄上清，用0.25%胰酶消化細胞5 min，終止消化后將細胞移入離心管中2000 r/min離心，用含1%檸檬酸鈉和0.075氯化鉀(1∶1)的低滲液低滲10 min, 用3∶1的固定液(甲醇：冰醋酸)預(yù)固定，1500 r/min離心棄上清，再以3∶2的固定液(甲醇：冰醋酸)固定兩次后，于染色體分散室中常規(guī)制片，G顯帶，然后進行羊水細胞染色體核型分析。每份標本至少計數(shù)30個分裂相，分析8～10個分裂相并保存圖片，核型描述按照人類細胞遺傳學(xué)命名國際體系ISCN 2016。

1.4 染色體微陣列分析(CMA) 按照Qiagen試劑盒(QIAamp DNA blood mini kit)操作說明提取基因組DNA。按照AffymetrixCytoScanTM750K芯片檢測標準操作流程對基因組進行酶切、連接、PCR擴增、純化、片段化、標記、雜交及掃描，通過ChAS(Chrosome analysis suite)軟件進行結(jié)果分析。對包含的連續(xù)探針數(shù)目≥50、片段長度≥100 kb的缺失和重復(fù)以及片段長度≥10 Mb的雜合性缺失進行分析，通過與NCBI、OMIM、DECIPHER Database、ISCA等公共數(shù)據(jù)庫進行對比分析所檢出CNV的性質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 異常核型統(tǒng)計結(jié)果 353例雙胎胎兒中，核型正常胎兒338例(95.75%)，異常核型15例(4.25%)，見表1。結(jié)構(gòu)異常見表2，標記染色體見表4序號14。

表1 染色體異常核型檢查結(jié)果

表2 檢出異常核型中結(jié)構(gòu)異常核型表

2.2 雙胎孕婦合并不同產(chǎn)前指征與染色體結(jié)果 通過總結(jié)353例雙胎孕婦中，雙胎合并超聲異常、無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果異常、不良孕產(chǎn)史等檢查指征進行分類統(tǒng)計分析，并對各類胎兒羊水染色體核型結(jié)果進行統(tǒng)計，分析各組中出現(xiàn)的染色體異常例數(shù)及在異?？倲?shù)中所占比例，見表3。單純雙胎查體中異常核型，見表4?；颊?2。雙胎合并血清學(xué)異常中的結(jié)果異常，見表4?；颊?。雙胎合并神經(jīng)系統(tǒng)異常中核型異常，見表4?；颊?3、15。雙胎合并心臟異常中染色體異常，見表4。患者1，患者14。雙胎合并腸管發(fā)育異常中異常結(jié)果，見表4?；颊?。雙胎合并無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果異常，見表4。患者3、4、7、8、9、10。雙胎合并其他異常中核型結(jié)果異常，見表4?；颊?、11。

表3 不同產(chǎn)前診斷指征異常核型檢出情況

2.3 核型異?；颊呓Y(jié)合CMA結(jié)果及其妊娠結(jié)局 本研究15例異常核型中，患者1～13(表4)核型結(jié)果與CMA結(jié)果一致為致病性，妊娠結(jié)局都是引產(chǎn)?；颊?4(表4)CMA結(jié)果為意義不明確CNV，經(jīng)遺傳咨詢后，孕婦選擇繼續(xù)妊娠，于孕36周剖腹產(chǎn)下一4.4斤健康男嬰?；颊?5(表4)CMA結(jié)果正常，證明在染色體易位過程中沒有基因的缺失或重復(fù)，核型為平衡易位，37周剖腹產(chǎn)一健康4.6斤男嬰。

2.4 核型正常CMA異常結(jié)果分析及妊娠結(jié)局 本研究中患者16～22(表4)核型結(jié)果正常，其中患者17、18 CMA結(jié)果良性變異，但患者17因其超聲嚴重異常為腹裂，孕婦決定引產(chǎn)；患者18為先心病，經(jīng)遺傳咨詢后繼續(xù)懷孕，后行剖宮產(chǎn)，胎兒于出生15天后夭折。

表4 CMA檢測結(jié)果為致病、意義不明確及隨訪結(jié)果異常的胎兒具體情況

3例CMA結(jié)果意義不明確，患者16選擇引產(chǎn)；患者20也選擇繼續(xù)妊娠，足月順產(chǎn)后超聲顯示其脈絡(luò)膜囊腫消失，孩子健康；患者22繼續(xù)妊娠后行剖宮產(chǎn)，胎兒于出生后由于心臟異常夭折。

2例CMA結(jié)果可能致病，患者19孕婦經(jīng)遺傳咨詢后決定繼續(xù)妊娠，后行剖宮產(chǎn)，生下一男孩有臍疝、腹股溝疝，后續(xù)情況我們會繼續(xù)追訪；患者21失訪。

3 討論

近年來，隨著輔助生殖技術(shù)的廣泛應(yīng)用及高齡孕產(chǎn)婦比例增加，雙胎妊娠的比例逐步上升[2-3]。雙胎妊娠的死亡率、患病率、流產(chǎn)率、胎兒畸形率、染色體異常風險明顯較單胎高[4-5]。據(jù)統(tǒng)計，雙胎出生缺陷的發(fā)生率為6.3%，遠高于單胎，且雙胎妊娠的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷復(fù)雜，準確性差并且咨詢難度更大[6]。雙胎妊娠的合子性決定了雙胎妊娠染色體風險是否相同,單卵雙胎遺傳物質(zhì)完全一致,而異卵雙胎發(fā)生染色體異常風險相互獨立。雙胎產(chǎn)前篩查推薦早孕期多項指標及多種篩查手段的聯(lián)合應(yīng)用，以提高檢出率，因此，所有雙胎都應(yīng)接受產(chǎn)前篩查，超聲篩查是早孕期篩查的重要手段，可直觀監(jiān)測胎兒生長狀態(tài)，明確其絨毛膜性[7-8]。目前并不推薦雙胎妊娠單獨進行血清學(xué)篩查,其準確性受到胎盤、胎兒鑲嵌、孕早期一胎死亡、單絨雙胎遺傳物質(zhì)不一致等原因影響準確性[6，9-13]。而對于無創(chuàng)DNA檢測，其檢測效率雖優(yōu)于傳統(tǒng)篩查方法[14]，但是對于異卵雙胎及雙胎中一胎消失的情況會影響無創(chuàng)DNA檢測的準確性。當無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果為高風險時并不能依此診斷異常胎兒，必須通過介入性產(chǎn)前診斷進行確診。

雙胎妊娠的介入性產(chǎn)前診斷應(yīng)用最廣泛的是絨毛膜取樣術(shù)和羊膜腔穿刺術(shù)[15]。對于雙絨雙羊雙胎需分別對兩個胎兒取樣，單絨雙胎只需取一個胎兒樣本，單絨雙胎其中之一或兩者都出現(xiàn)血清學(xué)和超聲異常尤其是結(jié)構(gòu)異常時需分別對兩個胎兒都取樣[16-17]。介入性產(chǎn)前診斷取樣的準確性直接影響雙胎染色體異常的精準診斷。近年來染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用尤其是在超聲檢查指標異常胎兒中應(yīng)用廣泛，對于染色體的微重復(fù)微缺失等細微結(jié)構(gòu)異常及單親二倍體或局部單親二倍體可通過染色體微陣列分析來檢測。而染色體G顯帶核型分析依舊是產(chǎn)前診斷的金標準[18]，可以直觀地發(fā)現(xiàn)其他基因檢測技術(shù)無法發(fā)現(xiàn)的易位、倒位等染色體異常。因此，產(chǎn)前診斷需要將核型分析與其他診斷技術(shù)結(jié)合起來，才能做到不漏檢。

從本研究患者檢查指征分類情況進行分析，雙胎合并高齡孕婦和雙胎合并心臟異常的歸類占比較高。多胎妊娠發(fā)生率會隨著高齡妊娠人群的增加而增加，其圍產(chǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生率也隨之增高，但高齡是否是雙胎的不良妊娠結(jié)局的獨立危險因素以及影響大小還需要更多的病例總結(jié)研究來證明。但高齡可直接或者間接通過表觀遺傳、DNA甲基化、染色質(zhì)重構(gòu)等遺傳因素以及生化和代謝過程影響機體，從而影響胎兒尤其是高齡雙胎疾病的發(fā)生、發(fā)展[19]。胎兒先天性心臟異常是先天性異常中致死率最高的疾病之一，近年來呈逐漸上升趨勢[20-22]。先天性心臟病多由單基因、多基因、染色體畸變引起。染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的異常均可導(dǎo)致先天性心臟病或是合并其他異常共同發(fā)生。本研究中患者2檢查指征為心臟異常，其核型結(jié)果為21三體綜合征，而先天性心臟畸形是該綜合征的常見臨床表現(xiàn)之一，常染色體綜合征如21三體綜合征、13三體綜合征、18三體綜合征、及性染色體異常的Turner綜合癥、69,XXY、69,XXX、69,XYY三倍體綜合征以及DiGeorge綜合征、22q11微重復(fù)綜合征等微缺失綜合征也常伴隨心臟異常。

本研究患者15染色體微陣列分析結(jié)果正常，證明該染色體易位為平衡易位。該患者是非同源染色體間的相互易位的攜帶者，染色體平衡易位因其無遺傳物質(zhì)丟失[22]，故表型正常，根據(jù)后期隨訪也表明該胎兒出生后表型正常。而患者14中的標志染色體經(jīng)CMA分析表明其為一無明確臨床意義的21q21.1區(qū)域2.1 M的重復(fù)?；颊?9、21皆核型結(jié)果正常，CMA結(jié)果為可能致病，其中患者19包含5q21.3q22.1約1.12 Mb的重復(fù)及8q12.2約440 kb的重復(fù)，包含部分CHD7 OMIM基因，該基因突變與顯性CHARGE綜合征相關(guān)；患者21 檢出15q11.2區(qū)域有約518 kb的重復(fù)，該區(qū)域包含TUBGCP5,CYFIP1,NIPA2,NIPA1 4個OMIM基因，該區(qū)域的重復(fù)與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病有關(guān)，但具有不完全外顯率，外顯率相對較低，患者臨床表現(xiàn)不一致[23]。以上患者皆體現(xiàn)了CMA在染色體微缺失微重復(fù)檢測的優(yōu)勢。這4個患者進一步體現(xiàn)了在介入性產(chǎn)前診斷中羊水核型染色體分析與染色體微陣列分析技術(shù)相結(jié)合的重要性。

4 結(jié)論

雙胎妊娠一直都是圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和胎兒醫(yī)學(xué)研究的重點，多胎妊娠染色體和胎兒結(jié)構(gòu)異常等風險均高于單胎妊娠，應(yīng)加強產(chǎn)前篩查，對于有高危指征的雙胎，介入性產(chǎn)前診斷的廣泛應(yīng)用可有效降低雙胎妊娠的出生缺陷。