非綜合征型耳聾患者遺傳性耳聾基因突變位點分析及遺傳咨詢

賀芳 趙明剛 李翠 拓園 王翔

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心·陜西省遺傳病診斷中心，陜西 西安 710061；2.北京安博迪恩生物技術有限公司，北京 100000)

耳聾是最常見的出生缺陷之一,截止2017年12月31日，全國殘疾人人口基礎庫主要數(shù)據(jù)顯示(http://www.cdpf.org.cn/)，陜西省總殘疾人1298496，占全國總殘疾人的3.8%，其中聽力言語殘疾占總殘疾人數(shù)的11.7%。耳聾與諸多因素有關,如遺傳、感染、噪聲、創(chuàng)傷、耳毒性藥物等，最主要因素為遺傳和環(huán)境,前者占50%以上，約70%的遺傳性耳聾為非綜合征型聾(Nonsyndromic hearing loss,NSHL)[1]。截止2020年2月5日，已確定的非綜合征性聽力損失基因多達123個(https://he-reditaryhearingloss.org/)，且具有高度的遺傳異質性及表型多樣性。目前，我國遺傳性耳聾研究多集中于新發(fā)突變位點的發(fā)現(xiàn)[2]與孕婦及新生兒的常見遺傳性耳聾基因篩查上[3-4]。在以下方面尚存在不足：①對非綜合征性耳聾患者的基因研究較少。②缺乏針對不同人群，不同地域進行個性化遺傳性耳聾篩查策略。③臨床耳聾遺傳咨詢工作尚缺乏落地有效個性化遺傳咨詢策略及方法。鑒于以上，本研究選取西安地區(qū)的246例耳聾患者進行相關遺傳性耳聾基因篩查，以摸索出更適合西安地區(qū)非綜合征聾人群體的基因篩查策略，并根據(jù)結果對不同個體提供個性化的遺傳咨詢。

1 對象與方法

1.1 對象 選取西安市一所聾啞學校、一所聾啞協(xié)會2014年11月～2018年3月遺傳咨詢門診接診的非綜合征型耳聾患者，共計246例?；颊?～64歲，平均(23.8±8.1)歲；男性125例，女性 121例；按照醫(yī)院倫理委員會管理規(guī)定由患者監(jiān)護人(18歲以下)或本人簽署知情同意書后，采集靜脈血2mL，EDTA管抗凝，-20℃保存，備用。

1.2 檢測內(nèi)容 依據(jù)微陣列芯片雜交技術，對人群中常見的4個基因GJB2、SLC26A4、線粒體12sRNA、GJB3，9個突變位點:235delC、35delG、176del16、299delAT、2168A>G、IVS7-2、1494C>T、1555A>G、538C>T進行基因篩查。GJB2、SLC26A4基因全外顯子測序。

1.3 DNA的提取 根據(jù)DNA提取試劑盒(康為CW5044S)中的操作流程，提取耳聾患者外周血標本中DNA，用核酸蛋白濃度分析儀SmartSpec Plus(Bio-Rad，美國)檢測DNA質量 (濃度80～180 ng/μL、OD值1.7～2.0)，放入-20℃冰箱，待用。

1.4 PCR擴增 在PCR試劑準備區(qū)，按照9項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(微陣列芯片法)配置PCR體系、進行擴增。

1.5 雜交及其芯片掃描 在PCR產(chǎn)物分析區(qū)，將14.5μL雜交混合液加入芯片點樣孔中，封閉雜交盒，60℃孵育1 h。之后在芯片洗干儀(晶芯?SlideWasherTM，博奧)中洗滌并甩干芯片，于微陣列芯片掃描儀(晶芯?LuxScanTM10K/B，博奧)中進行芯片掃描。

1.6 家系調查分析及遺傳咨詢 對基因芯片檢出為陽性的患者，建議其父母及兄弟姐妹進行此項篩查。對雜合突變及野生型個體，建議其行相關突變基因的全外顯子測序，同時針對以上結果，制作遺傳性耳聾基因識別卡片，為不同個體提供個性化遺傳咨詢。

1.7 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。利用Deaftest系統(tǒng)對芯片掃描結果進行分析。同時運用EXCEL2007建立患者的信息數(shù)據(jù)庫。

2 結果

2.1 224例耳聾患者以GJB2和SLC26A4基因突變?yōu)橹?本研究對246例耳聾患者進行遺傳性耳聾基因篩查，在篩查的4個常見突變基因中，分別檢出GJB2和SLC26A4基因突變43例(17.48%)、35例(14.23%)。發(fā)現(xiàn)線粒體12SrRNA突變7例(2.85%)，且均為1555A>G均質突變。GJB3基因未檢出突變，見圖1。

圖1 246例聾啞患者遺傳性耳聾基因突變的發(fā)生率

2.2GJB2和SLC26A4基因突變位點的多樣性 在檢出的43例GJB2基因突變患者中，存在9種突變類型(表1)，其中純合及復合雜合突變26例(60.47%)，雜合突變17例(39.53%)。另在35例SLC26A4基因突變個體中，檢出5種突變類型，其中純合及復合雜合突變12例(34.29%)，雜合突變23例(65.71%)。

表1 GJB2和SLC26A4基因突變位點檢出率

2.3 家系調查結果以GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者為主 對17個家系中的56人進行了遺傳性耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)在39例家系成員中，GJB2、SLC26A4基因突變攜帶者占比48.72%(19/39)。GJB2基因突變頻率35.90%(14/39)，其中以235delC、 299delAT突變?yōu)橹?；SLC26A4基因突變頻率為20.51%(8/39)，其中以IVS7-2A>G、2168A>G突變?yōu)橹?。另檢出1例線粒體12sRNA1555均質突變型成員，見表2。

表2 17個家系56例成員的家系調查結果

2.4GJB2和SLC26A4基因全外顯子測序分析，除檢出基因芯片包含突變位點外，還額外發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變位點。在遺傳咨詢中，結合咨詢者的愿望及需求，對兩對欲生育正常聽力后代的年輕聾啞夫婦，兩個已育有聾兒的家庭(欲再生育聽力正常后代)，和2例芯片篩查為野生型的耳聾患者，共12人進行了GJB2和SLC26A4基因全外顯子序列分析，并將測序結果與基因芯片結果進行比對(表3)，在基因芯片檢測范圍內(nèi)，GJB2和SLC26A4基因全序列分析結果與之一致。另有4例耳聾患者在GJB2基因的c.605ins46，c.79G>A，c.341A>G，c.257C>G，c.109G>A位點發(fā)生突變。

表3 12例樣本基因芯片結果及GJB2和SLC26A4基因全外顯子序列分析結果

2.5 遺傳咨詢 針對以上結果，為患者提供遺傳性耳聾基因識別卡片(圖2)，為不同需求的患者提供婚育、用藥、治療、預防等個性化遺傳咨詢。

圖2 遺傳性耳聾基因識別卡片

3 討論

在我國GJB2,SLC26A4,mtDNA12SrRNA基因是遺傳性聾高發(fā)的基礎,這些致聾基因所致的遺傳性聾有著較高的發(fā)病率[5-6], 但也存在地域差異[7-10]。在對西北地區(qū)耳聾患者的基因篩查中[11]，發(fā)現(xiàn)GJB2、SLC26A4基因的突變頻率分別為16.12%、10.54%，其中以235delC突變最為常見，占GJB2突變等位基因的65.71%。而在福建省107例非綜合征聽力損失人群基因檢測研究中[12]，GJB2基因突變占17.76%,其中以235delC、299delA為主。河南地區(qū)遺傳性耳聾基因篩查數(shù)據(jù)顯示[13]，GJB2基因突變頻率28.46%，SLC26A4基因突變頻率為 20.77%。本研究中，西安市246例非綜合征型耳聾患者遺傳性耳聾基因篩查數(shù)據(jù)顯示，GJB2和SLC26A4基因突變發(fā)生率分別為17.48%、14.23%，而GJB2基因突變中發(fā)生率較高的位點有：235delC、299delA；SLC26A4基因突變發(fā)生率較高的位點有2168A>G、IVS7-2。該數(shù)據(jù)略高于西北地區(qū)GJB2、SLC26A4基因的突變頻率，與福建省篩查數(shù)據(jù)相近，低于河南省GJB2、SLC26A4基因的突變頻率。2019年，國內(nèi)已出臺了針對孕婦和新生兒的遺傳性耳聾基因變異篩查技術專家共識[14]，而針對非綜合征性耳聾患者的基因突變篩查并未制定，本研究可為完善該人群聾病基因篩查提供一定的數(shù)據(jù)支持。

本研究對12例樣本GJB2和SLC26A4基因的全序列分析與基因芯片結果對比后發(fā)現(xiàn)，在基因芯片檢測范圍內(nèi)，測序結果與之一致。另外在檢測范圍之外，有4例患者存在其他突變類型，分別為：c.235delC/ c.605ins46復合雜合突變、c.235delC雜合/c.79G>A雜合/c.341A>G雜合、c.GJB2 257C>G/ c.299delAT復合雜合突變、c.GJB2 109G>A純合突變。分析以上額外發(fā)現(xiàn)的突變位點后，發(fā)現(xiàn)曾在2004年的學術交流會中，有報道過一例新生兒GJB2基因c.235delC/c.605ins46突變[15]，但對c.605ins46的致病性之后鮮少報道。2018年，在一個中國家庭中，發(fā)現(xiàn)c.257C>G/c.176del16復合雜合突變，而提出該位點的突變可能與該家系的聽力損失有關[16]。c.109G>A，c.79G>A,c.341A>G,突變在非綜合征型聾人中的發(fā)生頻率遠高于正常聽力人群，在流行病學意義上屬于致聾的危險因素[17-19]，可作為人群針對性的耳聾基因檢測在臨床上予以重視。總之，以上位點的額外檢出，可以為其致病基因位點研究提供臨床數(shù)據(jù)。同時，這也提示基因芯片篩查在檢測內(nèi)容上存在局限性，針對耳聾人群在排除遺傳因素致病方面應盡可能選擇位點更多，范圍更廣的檢測手段。但聾病基因篩查的大范圍推廣還有賴于較低的篩查成本，因此在西安地區(qū)，相較成本較高的基因全外顯子序列分析技術，基因芯片篩查以高通量、低成本、高準確率為特征，適時的選擇兩者的結合在臨床應用中為一種更好的策略。

在我國聾人群體中，聾聾結合是最常見的婚配模式。根據(jù)前期調查，21%聾人夫婦因相同基因突變致聾，其后代發(fā)生聾病幾率達100%，且無法通過產(chǎn)前診斷或者胚胎植入前診斷預防。遺傳性耳聾因其高度遺傳異質性、表型多樣性[20]，而使臨床遺傳咨詢具有高度復雜性。本研究針對不同個體提出了個性化的遺傳咨詢策略，為臨床遺傳性耳聾患者的遺傳咨詢提供了參考數(shù)據(jù)：①本研究中，表3中的聾兒家庭1，夫婦耳聾基因篩查均為GJB2 235delC雜合突變，育有一子，基因篩查結果為GJB2 235delC純合突變。該對夫婦欲再生育聽力正常后代，后行GJB2基因全序列分析顯示，父親GJB2基因c.235delC, c.79G>A, c.341A>G位點均存在雜合突變。鑒于以上，該對夫婦生育耳聾及攜帶者后代的風險較高，建議其借助輔助生殖技術，達到生育聽力正常后代的愿望。②1例耳聾患兒(表2，家系15)，6歲，五年前發(fā)現(xiàn)聽力進行性下降，3歲多時植入人工耳蝸，現(xiàn)語言發(fā)育可，基因篩查顯示為SLC26A4基因IVS7-2A>G/2168A>G復合雜合突變，家系調查發(fā)現(xiàn)其母親為SLC26A4 2168A>G雜合突變，父親為SLC26A4 IVS7-2A>G雜合突變，遺傳咨詢中告之其再生育耳聾后代的風險為25%。隨訪中得知該母親已孕21周，隨建議其對胎兒進行遺傳性耳聾基因的產(chǎn)前診斷，結果顯示胎兒仍為“SLC26A4基因IVS7-2A>G/2168A>G復合雜合突變”，進行過詳細的遺傳咨詢后，該對夫婦自愿選擇終止妊娠，有效避免了聾兒的出生。③線粒體基因1555A>G和1494C>T的突變，可導致藥物敏感性耳聾，攜帶該位點突變的個體，對氨基糖苷類藥物(如：慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素及丁胺卡那霉素等)異常敏感，通常很小的使用劑量就可能導致耳聾癥狀的出現(xiàn)。因此在本研究中，對檢出的7例1555A>G均質突變個體，均發(fā)放“遺傳性耳聾基因識別卡片”，囑其在以后就診時主動向醫(yī)師出示該卡片，以避免相關藥物的使用。同時追蹤母系成員，進行用藥指導，以實現(xiàn)聾病的一級預防。④在門診咨詢中，對確診為遺傳性耳聾的患者或攜帶者，在擇偶時應指導其避免選擇與自己相同耳聾基因突變的聾啞人或攜帶者(如圖2所示與自己相同卡片的人)，這樣可避免大部分聾聾婚配家庭生育聾病后代，實現(xiàn)耳聾的二級預防。

4 結論

本研究通過對西安地區(qū)246例非綜合征性耳聾患者行遺傳性耳聾基因篩查及后續(xù)個性化分析，在以下方面彌補了目前臨床上存在的不足：①選取非綜合征性耳聾患者進行基因相關研究，很好的擴充了該部分人群的遺傳性耳聾基因研究數(shù)據(jù)。②針對西安地區(qū)，結合經(jīng)濟成本的考慮，非綜合征性耳聾患者應以常見位點基因篩查為基礎，輔以深度測序技術的應用，將在突變位點的診斷上有所提高。③臨床耳聾遺傳咨詢，應結合基因檢測結果，以患者愿景為前提，在婚育、孕產(chǎn)、用藥等方面，制定個性化的遺傳咨詢策略，提出落地有效的實施方法，將三級預防方針滲透到遺傳咨詢的過程中。