血小板促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549增殖與遷移的體外實(shí)驗(yàn)研究

鄭鳳 董星宇 李慶林 朱婷 李白坤

血小板不但在止血和血栓形成中發(fā)揮重要作用，而且參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。近年來，血小板在腫瘤進(jìn)展中的作用也日益得到重視；研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可釋放組織因子、二磷酸腺苷、凝血酶等血小板激活因子，誘導(dǎo)血小板活化和促凝，起到幫助瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。但是，血小板是否具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，研究結(jié)果卻不一致；有的研究結(jié)果顯示血小板能促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖[1-2]，有的顯示抑制增殖[3]，還有的顯示與增殖無(wú)關(guān)[4]。導(dǎo)致這種不一致現(xiàn)象的原因比較復(fù)雜，瘤細(xì)胞種系就是一個(gè)重要因素。肺癌(lung cancer)是當(dāng)前全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，近年來肺癌的發(fā)病率和死亡率一直保持在相當(dāng)高水平；血小板是否促進(jìn)肺細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的增殖，尚不十分清楚。本文采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了血小板對(duì)A549細(xì)胞增殖作用和遷移力的影響，旨在為進(jìn)一步的藥物干預(yù)研究奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、材料

1 細(xì)胞株 肺腺癌細(xì)胞株A549來自安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心。

2 血小板提取相關(guān)試劑 ACD抗凝劑(Leagene公司)，CGS緩沖液(氯化鈉3.6 g、D-葡萄糖3.3 g、檸檬酸三鈉2.165 g，試劑溶解于400 mL超純水，調(diào)節(jié)PH至6.5，定容至500 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用)。

3 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑 DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)、胎牛血清(Biological Industries公司)、胰酶(碧云天公司)、雙抗(碧云天公司)、CCK-8(AbMole BioScience公司)、Transwell小室(BD FALCON公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(1U/mL雙抗)，置于37℃、含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2 血小板提取 抽取健康成年志愿者靜脈全血10 mL，用枸櫞酸(ACD)1 ∶7充分抗凝，水平離心機(jī)室溫200 g離心20 min，小心抽取上清得到富血小板血漿(PRP)，再1000 g離心10 min，棄上清后得到沉淀血小板。CGS緩沖液洗滌血小板，600 g離心5 min，洗滌2次后，預(yù)熱培養(yǎng)基重懸血小板，計(jì)數(shù)后制成3.0×108個(gè)/mL的血小板懸液。血小板制備后立即進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

3 鏡下觀察血小板與瘤細(xì)胞黏附情況 將貼壁的腫瘤細(xì)胞消化，250 g離心5 min，棄去上清，預(yù)熱培養(yǎng)基重懸，取200 μL細(xì)胞懸液移至1.5 mL EP管中，再取200 μL制備好的血小板懸液加入同一EP管中，振蕩混勻、封蓋，放置37 ℃水浴孵育1 h。反應(yīng)完成后取出EP管，輕輕搖勻后水平涂片，倒置顯微鏡下觀察血小板粘附腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。

4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM吹打制成細(xì)胞懸液。按5×103細(xì)胞/孔接種于96孔平底培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，并進(jìn)行分組加樣：①對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)液；②Cell+P50組：DMEM培養(yǎng)液，2.5×105個(gè)血小板(PLT)；③Cell+P100：DMEM培養(yǎng)液，5×105個(gè)PLT；④Cell+P200：DMEM培養(yǎng)液，1×106個(gè)PLT；⑤Cell+P400：DMEM培養(yǎng)液，2×106個(gè)PLT；⑥Cell+P600：DMEM培養(yǎng)液，3×106個(gè)PLT；⑦Cell+P800：DMEM培養(yǎng)液，4×106個(gè)PLT；另設(shè)空白組；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組均設(shè)三塊板，分別于孵育24、48和72 h后，采用CCK-8實(shí)驗(yàn),測(cè)試細(xì)胞增殖力。CCK-8實(shí)驗(yàn)操作按說明書進(jìn)行，主要是更換培養(yǎng)基，加CCK-8試劑，避光孵育1h，酶標(biāo)儀450nm下測(cè)定各孔的吸光度值。最后根據(jù)說明書提供的公式計(jì)算細(xì)胞增殖力。

5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移力 收集適量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘤細(xì)胞，胰酶消化后無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104mL-1。設(shè)A549細(xì)胞組(Transwell小室加入100μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)基)，和A549+PLT組(在A549組的基礎(chǔ)上，加2 μl血小板懸液于上室中)。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。取出小室，棄掉培養(yǎng)基，先用棉簽小心擦掉上室內(nèi)的細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS洗2次，再加入4%多聚甲醛固定30 min，適度風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，預(yù)冷的PBS洗3次。倒置顯微鏡下選取上下左右中5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)小室下表面附著的細(xì)胞(遷移細(xì)胞)數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、血小板向瘤細(xì)胞聚集

與貼壁后的瘤細(xì)胞共孵育1 h后，血小板的分布不再均勻，出現(xiàn)向瘤細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，即瘤細(xì)胞周圍的血小板密度明顯增高(圖1)。

圖1 血小板向瘤細(xì)胞聚集的現(xiàn)象(×100)

二、血小板促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖

不同血小板加入量及共孵育時(shí)間對(duì)瘤細(xì)胞增殖的影響情況(見表1)。由(表1)和(圖2)可見，隨著血小板加入量的增加，瘤細(xì)胞的增殖力總體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中共孵育48 h者最明顯。在共孵育24 h的7組中，組間增殖力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.431，P=0.001)，且6個(gè)加血小板組的瘤細(xì)胞增殖力均高于未加血小板組(P<0.05)；共孵育48 h(F=7.560，P=0.001)和共孵育72 h(F=17.159，P<0.001)的瘤細(xì)胞組間增殖力差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除cell+P50組外，其他加血小板組的瘤細(xì)胞增殖力均高于未加血小板組(P<0.05)。

表1 三種共孵育時(shí)間下血小板對(duì)A549細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

圖2 血小板加入量對(duì)瘤細(xì)胞增殖力的影響(*P<0.05)

由(表1)和(圖3)可見，共孵育的時(shí)長(zhǎng)在也可影響血小板對(duì)瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。血小板加入量較少的3個(gè)組，三個(gè)不同作用時(shí)長(zhǎng)對(duì)瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而血小板加入量較多的3個(gè)組，這種促增殖作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(cell+P400組：F=10.750、P=0.010，cell+P600組：F=5.061、P=0.049，cell+P800組：F=8.727、P=0.017)，且均表現(xiàn)為共孵育48小數(shù)者強(qiáng)于共孵育24小數(shù)者(P<0.05)。

圖3 與血小板共孵育時(shí)間對(duì)瘤細(xì)胞增殖力的影響(*P<0.05)

(圖4)更清晰地展示了瘤細(xì)胞與不同數(shù)量血小板共孵育下，其增殖活力逐漸增強(qiáng)的變化趨勢(shì)；以及同一血小板加入量下，不同共孵育時(shí)間瘤細(xì)胞增殖活力的變化情況。呈現(xiàn)出血小板加入量少時(shí)共孵育時(shí)間24 h為佳，加入量多時(shí)共孵育時(shí)間48小數(shù)為佳，不管加入量多少共孵育72 h都不理想的有趣現(xiàn)象。

圖4 血小板數(shù)量及共孵育時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

三、血小板促進(jìn)瘤細(xì)胞遷移

(圖5)為Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的鏡下結(jié)果，可見與血小板共孵育24 h后的A549細(xì)胞，其遷移能力明顯高于對(duì)照組( 128.6±16.0vs84.4±12.0 )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 血小板促進(jìn)A549細(xì)胞遷移(×100),*P<0.05

討 論

肺癌嚴(yán)重危害人類健康，特別是非小細(xì)胞肺癌危害更甚[5]。醫(yī)學(xué)的進(jìn)步在一定程度上改善了肺癌患者的預(yù)后，但五年生存率依然不高。探究影響肺癌發(fā)生發(fā)展的因素，將有利于控制肺癌進(jìn)展，減輕其所致的健康危害。

許多實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，血小板能直接與瘤細(xì)胞相互作用，分泌生物活性蛋白參與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。如有研究結(jié)果顯示，血小板可促進(jìn)Lewis肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而采用抗血小板藥(替卡格雷)則能抑制Lewis肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并能誘導(dǎo)血小板凋亡[6]。血小板也可通過上調(diào)c-MYC癌蛋白促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖，而此增殖能力可被阿司匹林逆轉(zhuǎn)，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系[7]。血小板還可通過影響血管生成發(fā)揮促進(jìn)卵巢癌生長(zhǎng)的作用[8]。腫瘤患者的血小板也能顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖[9]。

本研究結(jié)果提示，血小板可促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和遷移力，且隨著血小板加入量的增加，其促瘤增殖作用呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。此外，隨著與瘤細(xì)胞共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，血小板的促瘤增殖作用呈現(xiàn)先增強(qiáng)再減弱的趨勢(shì)；可能提示血小板對(duì)瘤細(xì)胞發(fā)揮作用需要一定的時(shí)間，但在沒有持續(xù)血小板補(bǔ)充的情況下，一次加入的血小板難以維持較久的促瘤增殖作用。本研究的結(jié)果為血小板促進(jìn)腫瘤增殖和遷移增加了證據(jù)，也為進(jìn)一步開展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床干預(yù)試驗(yàn)提供了參考數(shù)據(jù)。

然而，血小板對(duì)腫瘤細(xì)胞并非總是表現(xiàn)出促增殖的作用。如有報(bào)道稱，健康人的血小板沒有明顯的促肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖作用[9]。也未發(fā)現(xiàn)血小板對(duì)SW620癌細(xì)胞增殖的影響[7]。甚至還有報(bào)道血小板可抑制黑色素瘤細(xì)胞和前例腺癌細(xì)胞[3]、結(jié)腸癌細(xì)胞[10]的增殖。這些研究結(jié)果提示，血小板對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有無(wú)影響以及是促進(jìn)或抑制作用，可能與瘤細(xì)胞株的種類有關(guān)；誠(chéng)然，隱藏在這種現(xiàn)象背后的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究闡明。

簡(jiǎn)言之，本研究明確了血小板對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用，提示血小板可能具有作為肺癌治療潛在靶點(diǎn)的價(jià)值，但需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。