miR-7-5p調(diào)控NF-κB/RelA信號(hào)通路對(duì)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制研究

李同林 秦克 宮帥

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是進(jìn)展性的呼吸系統(tǒng)疾病，吡非尼酮可治療IPF，但發(fā)病率正在上升[1-3]，控制IPF進(jìn)展的機(jī)制仍不清楚。microRNAs是一個(gè)長(zhǎng)度為22nt的非編碼RNA，可結(jié)合mRNA的3'UTR調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4-5]，識(shí)別特異性miRNA可以進(jìn)一步了解發(fā)病機(jī)制。研究表明miRNAs在肺纖維化在內(nèi)的疾病中發(fā)揮作用[6-8]。例如miR-21介導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞的纖維化激活。研究發(fā)現(xiàn)miR-7-5p參與了疾病的發(fā)展，如miR-7-5p過(guò)表達(dá)調(diào)控TK6細(xì)胞的增殖[9]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮作用，在此期間，E-cadherin表達(dá)丟失，Vimentin和N-cadherin表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞獲得侵襲能力[10]。TGF-β在細(xì)胞發(fā)育或腫瘤發(fā)展條件下會(huì)誘導(dǎo)EMT發(fā)生，單純的TGF-β刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞EMT[11]。因此，本研究主要是探討miR-7-5p在TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的意義及作用機(jī)制。

資料與方法

一、主要材料

Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle's medium)培養(yǎng)基、2.5g/L胰酶和Turbofect購(gòu)于Thermo Fisher Scientific； Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser來(lái)自日本Takara公司；Transwell小室購(gòu)自Conring公司；結(jié)晶紫由Sigama公司提供；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體來(lái)自英國(guó)Abcam；miR-7-5p mimics、miR-7-5p inhibitor來(lái)自GenePharma公司；RelA siRNA質(zhì)粒來(lái)自上海生工生物工程有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 細(xì)胞培養(yǎng) 取狀態(tài)良好的A549細(xì)胞，培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37℃、5% CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱，細(xì)胞匯合度為95%左右時(shí)傳代培養(yǎng)。

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)75%時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，用空DMEM培養(yǎng)基覆蓋單層，取Turbofect、重組質(zhì)粒、Opti-MEM混勻于新的EP管，靜置20 min，緩慢滴加于細(xì)胞中，晃勻后置于培養(yǎng)箱，2h后棄上清，添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h后收集RNA樣和蛋白樣。

3 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 根據(jù)TargetScan軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，PCR擴(kuò)增目的片段，構(gòu)建RelA wt載體。序列比對(duì)正確后再通過(guò)點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建RelA mut載體。將A549細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)75%時(shí)，用空DMEM培養(yǎng)基覆蓋單層，將RelA wt、RelA mut分別與miR-7-5p mimics、mimics NC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，48 h后使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性強(qiáng)度。

4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取4 ℃融化的matrigel，用DMEM稀釋至其濃度為1mg/mL，每孔鋪100μL matrigel添于每個(gè)小室中，干燥使其成膠狀。將狀態(tài)良好的A549細(xì)胞添加到Transwell小室，下室添加完全DMEM培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48h，拭去matrigel膠，用多聚甲醛固定20 min， 0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況，拍照并記數(shù)。

5 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將各組稀釋后的單細(xì)胞懸液按3×105個(gè)/孔的密度鋪在6孔板，觀察細(xì)胞鋪滿板底后，取200 μL槍頭，制造細(xì)胞線性劃痕，PBS清洗2次，加入空培養(yǎng)基，48 h后觀察細(xì)胞遷移距離。拍照并使用ImageJ軟件分析結(jié)果。

6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 取出保存RNA樣品，提取細(xì)胞總RNA，按cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)分別將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照熒光定量PCR試劑盒配置反應(yīng)體系，用(表1)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，程序：預(yù)變性95℃，10 min，變性95℃，10 s，退火60℃，20 s，延伸72℃，30 s，40個(gè)循環(huán)，所有反應(yīng)均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，用2-△△Ct法分析結(jié)果。

表1 引物序列

7 Western blot 轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞蛋白樣，提取總蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，配置蛋白膠，取50μg蛋白點(diǎn)樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜，PVDF膜浸泡于5%脫脂奶粉配置的封閉液，3 h后將PVDF膜置于特異性一抗，4℃搖床孵育，TBST清洗，PVDF膜置于二抗中，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗脫P(yáng)VDF膜，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行蛋白曝光。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，當(dāng)P>0.05時(shí)，表示差異不顯著；當(dāng)P<0.05時(shí)，表示差異顯著或極顯著。

結(jié) 果

一、miR-7-5p在TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

由(圖1A) Western blot和(圖1B)結(jié)果表明，10 ng/mL TGF-β1處理A549細(xì)胞12 h、24 h 和48h后，EMT 相關(guān)蛋白 E-cadherin 表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，N-cadherin 表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，Vimentin 表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，表明TGF-β1 作用A549 細(xì)胞后明顯誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了EMT。由(圖1C) RT-qPCR結(jié)果可知，和Control組相比，10 ng/mL 的TGF-β1處理 A549細(xì)胞12 h、24 h 和48h后細(xì)胞內(nèi)miR-7-5p表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。以上結(jié)果表明miR-7-5p在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

圖1 miR-7-5p在TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

二、過(guò)表達(dá)miR-7-5p抑制A549細(xì)胞侵襲、遷移和EMT

由(圖2A)可知，和Control或mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組的miR-7-5p表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。由(圖2B-2C)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組的細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)。由(圖2D-2E)細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低(P<0.01)。由(圖2F-2G) Western blot結(jié)果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，Vimentin 表達(dá)明顯下降(P<0.01)，E-cadherin 表達(dá)明顯上升(P<0.01)。以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-7-5p抑制A549細(xì)胞侵襲、遷移和EMT。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-7-5p抑制A549細(xì)胞侵襲、遷移和EMT

三、下調(diào)miR-7-5p促進(jìn)A549細(xì)胞增殖、侵襲和EMT

由(圖3A)可知，和Control或inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組的miR-7-5p表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。由(圖3B-3C)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組的細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)。由(圖3D-3E)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組細(xì)胞劃痕愈合率明顯升高(P<0.01)。由(圖3F-3G) Western blot結(jié)果可知，和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)，Vimentin蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。以上結(jié)果表明下調(diào)miR-7-5p促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲、遷移和EMT。

圖3 下調(diào)miR-7-5p促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲、遷移和EMT

四、miR-7-5p對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

由(圖4A-4B)結(jié)果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組細(xì)胞內(nèi)TAK1和p65磷酸化水平明顯降低，p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明顯降低(P<0.01)；和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)TAK1和p65磷酸化水平明顯升高，p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p6/NF-κB p65比值明顯增加(P<0.01)；。以上結(jié)果表明，下調(diào)miR-7-5p能夠激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路。

圖4 miR-7-5p對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

五、miR-7-5p與NF-κB/RelA的靶向和負(fù)調(diào)控關(guān)系

生物學(xué)信息軟件TargetScan預(yù)測(cè)miR-7-5p和RelA之間的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)(圖5A)。由(圖5B)結(jié)果可知，和RelA wt+mimics NC組相比，RelA wt+miR-7-5p mimics組細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，和HRelA mut+mimics NC組相比，RelA mut+miR-7-5p mimics組細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。由(圖5C)結(jié)果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組RelA基因表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組RelA基因表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。以上結(jié)果表明，miR-7-5p與HOXA5之間具有靶向和負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖5 miR-7-5p與NF-κB/RelA的靶向和負(fù)調(diào)控關(guān)系

六、下調(diào)RelA抑制A549細(xì)胞侵襲、遷移和EMT

由(圖6A) RT-qPCR結(jié)果可知，和Control組相比，10 ng/mL 的TGF-β1處理 A549細(xì)胞12 h、24 h 和48h后細(xì)胞內(nèi)RelA表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。由(圖6B)可知，和Control或siRNA NC組相比，RelA siRNA組的RelA表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。由(圖6C-6D)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，和siRNA NC組相比，RelA siRNA組的細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)。由(圖6E-6F)細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，和siRNA NC組相比，RelA siRNA組細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低(P<0.01)。由(圖6G-6H) Western blot結(jié)果可知，和siRNA NC組相比，RelA siRNA組細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，Vimentin 表達(dá)明顯下降(P<0.01)，E-cadherin 表達(dá)明顯上升(P<0.01)。以上結(jié)果表明下調(diào)RelA抑制A549細(xì)胞侵襲、遷移和EMT。

討 論

特發(fā)性肺纖維化( IPF)是一種嚴(yán)重的肺部疾病，其特征是不可逆的、進(jìn)行性的肺功能喪失，迅速導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡率增加[12]，診斷時(shí)的生存率與肺惡性腫瘤是相似的。對(duì)IPF發(fā)病機(jī)制的最新研究表明，異常的傷口愈合、有缺陷的再上皮化、成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變、以及在成纖維細(xì)胞灶處增生性肺炎細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分的過(guò)量積累，導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)破壞[13]。近些年研究表明直接參與纖維化、肌成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的microRNAs包括miR-21、miR-29和let-7家族成員[14]。IPF成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中miR-21表達(dá)增強(qiáng)，這在惡性疾病也可見(jiàn)。miR-29家族是在肺、心臟和肝臟纖維化疾病中發(fā)現(xiàn)的首批下調(diào)的microRNAs之一。miR-29通過(guò)抑制ECM(包括膠原蛋白)以及調(diào)節(jié)膠原蛋白合成，交聯(lián)和降解的酶發(fā)揮作用[15]。根據(jù)之前的報(bào)道，在IPF發(fā)病機(jī)制中對(duì)miR-210、miR-185、miR-302c-3p、miR-376c和miR423-5p在慢速和快速IPF進(jìn)展中差異表達(dá)。以上研究表明，microRNAs與IPF的發(fā)展具有一定的聯(lián)系。而在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了miR-7-5p進(jìn)行探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-7-5p在TGF-β1 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞 EMT 模型中表達(dá)下調(diào)，結(jié)果提示我們miR-7-5p的異常表達(dá)參與了肺纖維化的發(fā)展，可能通過(guò)影響肺泡上皮細(xì)胞 EMT進(jìn)程進(jìn)而發(fā)揮作用。

圖6 下調(diào)RelA抑制A549細(xì)胞侵襲、遷移和EMT

研究表明EMT 在癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病包括肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是一個(gè)可逆過(guò)程。EMT在癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中會(huì)使上皮細(xì)胞演變成不規(guī)則的間充質(zhì)細(xì)胞。在此過(guò)程中，細(xì)胞間粘附減少，繼而使細(xì)胞遷移和侵襲能力增加。細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程時(shí)，上皮標(biāo)志物如 E-cadherin 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物如 Vimentin、N-cadherin和α-SMA蛋白出現(xiàn)上調(diào)[16-17]。受此啟發(fā)，我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中評(píng)估了miR-7a-5p在A549細(xì)胞侵襲、遷移和 EMT過(guò)程中的作用。結(jié)果表明在A549細(xì)胞，上調(diào)miR-7a-5p表達(dá)后，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)、而N-cadherin、Vimentin表達(dá)下調(diào)，且A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯受到抑制。另外下調(diào)miR-7a-5p表達(dá)后，明顯促進(jìn)了A549細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT。我們猜想，miR-7a-5p可能通過(guò)調(diào)影響A549細(xì)胞的EMT而參與肺纖維化進(jìn)程。近些年有很多文獻(xiàn)報(bào)道了NF-κB/RelA與各種癌癥以及肺纖維化疾病之間的關(guān)系。如磷酸化的RB通過(guò)抑制NF-κB活化和PD-L1表達(dá)來(lái)提高癌癥免疫力[18]。抑制NF-κB通路可通過(guò)下調(diào)胰腺癌中的Bcl-2來(lái)增強(qiáng)卡巴他賽的抗腫瘤作用[19]。另外還發(fā)現(xiàn)HMGB1通過(guò)NF-κB激活TGF-β1誘導(dǎo)的特發(fā)性肺纖維化疾病。林箐等人發(fā)現(xiàn)肺組織中PPARγ的表達(dá)減弱，NF-κB的表達(dá)增強(qiáng)在肺纖維化的發(fā)病過(guò)程中起作用[20]。TAKl是絲裂原激活蛋白激酶家族的重要組成部分，結(jié)合TAB1蛋白的C端后被激活，磷酸化TAKl修飾活化環(huán)上的Ser192、 Thr168、 Thr187 殘基，激活了下游信號(hào)通路，另外活化后的TAK1會(huì)激活NIK最終活化NF-κB通路。而在本研究中我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-7-5p使p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明顯升高，激活了細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路，另外用TargetScan預(yù)測(cè)還發(fā)現(xiàn)miR-7-5p和RelA具有靶向作用，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR驗(yàn)證了二者的相互作用和負(fù)調(diào)控關(guān)系。且RelA在TGF-β1 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞 EMT 模型中表達(dá)上調(diào)，siRNA下調(diào)RelA表達(dá)后明顯抑制了A549細(xì)胞的侵襲、遷移和 EMT。表明miR-7-5p對(duì)A549細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用可能是通過(guò)RelA實(shí)現(xiàn)的。然而在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程和腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理過(guò)程中，胞內(nèi)很多信號(hào)通路如PI3K-AKT、Wnt/β-catenin、JAK-STAT和ERK/MAPK等都會(huì)參與其中，而在本研究中我們只討論了NF-κB通路和RelA一個(gè)作用靶點(diǎn)，這也是本文的不足之處，miR-7-5p可能會(huì)通過(guò)其它靶點(diǎn)或者是其它通路來(lái)發(fā)揮其功能，因此miR-7-5p調(diào)控A549細(xì)胞發(fā)展的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究表明miR-7-5p調(diào)控NF-κB/RelA信號(hào)通路促進(jìn)A549細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，為深入探討肺纖維化的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。