免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合放化療治療非小細(xì)胞肺癌的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物研究進(jìn)展

陳鴻志 周永慧 李燕 苗立云

肺癌已成為我國死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的85%～90%，且發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)[1]。大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌診斷時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無法手術(shù)治療。放療、化療、靶向治療和抗血管生成治療是晚期非小細(xì)胞肺癌患者的主要治療方法。而腫瘤免疫治療在肺癌中的應(yīng)用既往一直未有突破性的進(jìn)展，其治療策略主要集中于直接提高抗腫瘤主動(dòng)免疫(如過繼性細(xì)胞免疫治療)[2]。隨著對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境研究的深入，免疫檢查點(diǎn)(immune checkpoint)在腫瘤免疫逃逸中的作用逐漸被重視，而針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)開始進(jìn)入臨床應(yīng)用，并顯示出一定的治療效果。其中，程序性死亡受體-1/配體-L1(programmed cell death 1，PD-1/Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)抑制劑已經(jīng)獲批應(yīng)用于晚期非小細(xì)胞肺癌的治療。

然而，免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)單藥治療雖然有緩解期長(zhǎng)等一些優(yōu)點(diǎn)，但總體客觀有效率仍偏低。一些生物標(biāo)志物的檢測(cè)可以預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效，目前推薦ICIs使用前，需明確免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子(如PD-L1)的表達(dá)水平，以提前發(fā)現(xiàn)目標(biāo)獲益人群。這在一定程度上解決了ICIs盲目應(yīng)用的問題，但單藥應(yīng)用獲益人群比例不高。近年來，多項(xiàng)臨床研究表明ICIs聯(lián)合常規(guī)放、化療能夠顯著改善晚期非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后，這為ICIs的臨床應(yīng)用擴(kuò)大了適應(yīng)證，但預(yù)測(cè)ICIs單藥治療療效的生物標(biāo)志物是否可用來指導(dǎo)其聯(lián)合常規(guī)放、化療尚不明確，如何篩選獲益較大的人群是目前臨床面臨的主要問題。本文就PD-1/PD-L1抑制劑及其與放、化療聯(lián)合應(yīng)用的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物進(jìn)行綜述。

PD-1/PD-L1抑制劑的作用機(jī)制

免疫逃逸是惡性腫瘤的十大特征之一，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的原因是腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫抑制因素，其中包括免疫檢查點(diǎn)(immune checkpoint)的配體與受體結(jié)合、抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)活化。免疫檢查點(diǎn)是一大類表達(dá)于免疫細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等并發(fā)揮抑制或激活獲得性免疫系統(tǒng)的分子，包括CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG3、B7-H3、TIM3等[3]。

PD-1屬于CD28免疫球蛋白超家族的共抑制分子，其編碼基因PDCD1位于2號(hào)染色體,主要表達(dá)在激活的T細(xì)胞、B細(xì)胞表面和自然殺傷細(xì)胞表面，與程序性死亡蛋白配體-1(PD-L1)或程序性死亡蛋白配體-2(PD-L2)結(jié)合，抑制T細(xì)胞的抗腫瘤活性，所以PD-1/PD-L1信號(hào)通路成為抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[4]。PD-L1在腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞都有表達(dá)，而PD-L2主要在激活的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上表達(dá)。表達(dá)于腫瘤細(xì)胞或其他腫瘤間質(zhì)細(xì)胞表面的PD-L1可以作用于CTL細(xì)胞表面受體PD-1，通過抑制PI3K/Akt和Ras-MEK-ERK信號(hào)通路抑制T淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡[5]。PD-1/PD-L1單抗通過阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合，解除CTL細(xì)胞的免疫抑制，恢復(fù)CTL細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能。

目前國內(nèi)外針對(duì)PD-1/PD-L1的抑制劑已有數(shù)種，主要包括PD-1單抗國外的Pembrolizumab(帕博利珠單抗)、Nivolumab(納武利尤單抗)、國內(nèi)的Cemiplimab(西米普利單抗)、Tislelizumab(替雷利珠單抗)、Toripalimab(特瑞普利單抗)、Sintilimab(信迪利單抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠單抗)和PD-L1單抗國外的Durvalumab(度伐利尤單抗)、Atezolizumab(阿替利珠單抗)、Avelumab(阿維魯單抗)等。其中，Pembrolizumab、Nivolumab、Durvalumab和Atezolizumab單藥治療已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批用于晚期非小細(xì)胞肺癌的二線治療,同時(shí)，Pembrolizumab被批準(zhǔn)用于PD-L1高表達(dá)(腫瘤比例評(píng)分(TPS)≥50%)且無表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因突變的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的一線單藥治療[6]。

PD-1/PD-L1抑制劑單藥治療的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物

PD-1/PD-L1抑制劑單藥治療總體客觀緩解率較低。CheckMate-063[7]、CheckMate-017[8]和CheckMate-057試驗(yàn)[9]表明單用Nivolumab雖然與化療相比能夠提高晚期非小細(xì)胞肺癌治療的客觀緩解率，但均未超過20%。而Keynote-001試驗(yàn)[10]表明，單用Pembrolizumab總體客觀緩解率也僅為27%。所以，如何提高ICIs治療靶標(biāo)人群的客觀有效率是近年來研究熱點(diǎn)。一些可以預(yù)測(cè)ICIs治療療效的標(biāo)志物被陸續(xù)報(bào)道，如腫瘤PD-L1表達(dá)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其細(xì)胞PD-L1的表達(dá)、腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞、腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或腸道微生物群等，最新研究也發(fā)現(xiàn)IL-35和POLE基因在腫瘤免疫治療療效預(yù)測(cè)方面有著一定的作用。

一、腫瘤PD-L1表達(dá)

2015年FDA批準(zhǔn)Pembrolizumab用于PD-L1表達(dá)≥50%的晚期非小細(xì)胞肺癌的一線治療，但應(yīng)用Nivolumab或Atezolizumab的療效與PD-L1表達(dá)之間的關(guān)系還沒有完全得到證實(shí)。 Patel等[11]總結(jié)發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)陽性的非小細(xì)胞肺癌患者接受免疫治療有效率超過60%，而PD-L1表達(dá)陰性的患者治療客觀有效率很低。Keynote-001[10]、Keynote-010[12]和Impower-131[13]研究發(fā)現(xiàn)免疫治療在PD-L1陽性表達(dá)的患者中顯著獲益。而CheckMate-026研究[14]發(fā)現(xiàn)Nivolumab并沒有延長(zhǎng)PD-L1表達(dá)≥50%的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的總生存期和無進(jìn)展生存期。以上不同研究結(jié)果導(dǎo)致PD-L1作為免疫治療的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)仍存在較大爭(zhēng)議，其中的原因可能有[11]：(1)各臨床研究關(guān)于PD-L1陽性表達(dá)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)不同：在Keynote臨床試驗(yàn)中，PD-L1表達(dá)≥50%為陽性表達(dá)，而在CheckMate-063和CheckMate-026試驗(yàn)中，PD-L1表達(dá)≥5%即為陽性表達(dá)；(2)檢測(cè)腫瘤PD-L1表達(dá)的抗體和免疫組化方法均不同，因此得出的結(jié)論亦會(huì)有所差別；(3)腫瘤的異質(zhì)性：由于PD-L1在腫瘤中的表達(dá)存在異質(zhì)性，包括時(shí)間異質(zhì)性及空間異質(zhì)性，所以僅靠檢測(cè)局部PD-L1的表達(dá)并不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腫瘤免疫微環(huán)境；(4)PD-L1的表達(dá)亦與EGFR和KRAS基因突變有關(guān),并且化療會(huì)影響PD-L1表達(dá)；(5)有研究表明，少部分PD-L1表達(dá)陰性的晚期非小細(xì)胞肺癌患者仍能從中獲益，因此對(duì)于PD-L1表達(dá)是否和免疫治療療效一定呈正相關(guān)，存在爭(zhēng)議[15]。因此，單獨(dú)憑借PD-L1表達(dá)水平并不能較全面的預(yù)測(cè)免疫治療預(yù)后。不過通過對(duì)PD-L1表達(dá)評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)化可能會(huì)進(jìn)一步提高PD-L1的預(yù)測(cè)價(jià)值，目前常用的標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)有腫瘤比例評(píng)分(TPS，tumor proportion score)和聯(lián)合陽性評(píng)分(CPS，combined positivity score)[16]。

二、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)(CTC及CTC-PD-L1)

近年來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell，CTC)及其細(xì)胞PD-L1的表達(dá)(CTC-PD-L1)可作為新的非侵入性的預(yù)測(cè)晚期非小細(xì)胞免疫治療的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)標(biāo)志物。CTC即為自發(fā)或因診療操作脫離原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。在Frick等[17]人的研究中發(fā)現(xiàn)，CTC可以用來預(yù)測(cè)早期非小細(xì)胞肺癌患者接受立體定向放療后的療效，更高的基線CTC會(huì)增加腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。Castello等[18]人亦發(fā)現(xiàn)CTC是非小細(xì)胞肺癌患者免疫治療無進(jìn)展生存期及總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，那么是否有可能將CTC作為放療聯(lián)合免疫治療的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，這需要進(jìn)一步的研究。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)CTC-PD-L1表達(dá)陽性，是化療預(yù)后不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，而化療可以誘導(dǎo)CTC-PD-L1表達(dá)的上調(diào)，化療聯(lián)合免疫治療可以增加抗腫瘤療效，從而使更多的患者獲益。但是，CTC及CTC-PD-L1是否可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)免疫治療聯(lián)合放化療的療效，仍面臨著極大的考驗(yàn)，這主要是有以下幾點(diǎn)原因：(1)檢出率低，不同檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)數(shù)據(jù)庫之間有顯著差異；(2)CTC-PD-L1的檢測(cè)，需充分考慮在接受免疫治療前既往放化療、靶向治療等治療史的影響；(3)檢測(cè)成本高，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。因此，雖然CTC及CTC-PD-L1相較腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)檢測(cè)更加安全并且可以動(dòng)態(tài)觀察，但是目前并不能取代其地位。

三、腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)

腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞(Tumor Infiltrates Lymphocytes，TIL)是一群異質(zhì)性很強(qiáng)的細(xì)胞，其中一部分是抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，在非小細(xì)胞肺癌中，TIL數(shù)量與患者的預(yù)后直接相關(guān)[20]。TIL通過細(xì)胞毒作用和介導(dǎo)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。TIL引起腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制包括：(1)TIL激活后，其分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子增多，可以誘導(dǎo)非特異性免疫反應(yīng)；(2)TIL通過穿孔素和顆粒酶等直接靶向腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)靶細(xì)胞凋亡。有研究顯示TIL數(shù)量可作為晚期非小細(xì)胞肺癌患者免疫治療療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)[19]，但在臨床試驗(yàn)中尚未得到進(jìn)一步證實(shí)。

四、腫瘤突變負(fù)荷(TMB)

腫瘤突變負(fù)荷(Tumor Mutational Burden，TMB)是指腫瘤細(xì)胞編碼基因突變的總和，包括堿基替換、基因插入、缺失錯(cuò)誤等的總數(shù)[21]。腫瘤細(xì)胞編碼基因的突變預(yù)示著腫瘤相關(guān)特異性抗原的產(chǎn)生，所以理論上突變?cè)蕉啵[瘤新抗原(Neoantigen)產(chǎn)生越多，免疫治療療效越好。CheckMate-227等研究均證實(shí)高腫瘤突變負(fù)荷的患者從免疫治療獲益更多[22]。但是，腫瘤突變負(fù)荷作為免疫治療生物標(biāo)志物仍面臨著極大的挑戰(zhàn)，主要有以下幾種原因：(1)腫瘤突變負(fù)荷因不同計(jì)算方法或檢測(cè)基因的數(shù)量多少會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果，目前主要用來檢測(cè)腫瘤突變負(fù)荷的方法主要有FoundationOne CDx和MSK-IMPACT[23]；(2)腫瘤突變負(fù)荷閾值的判定在各研究中差別大。如CheckMate-026[14]研究中直接定義為突變數(shù)量(低突變負(fù)荷，<100 mutations；中等突變負(fù)荷100 to 242 mutations；高突變負(fù)荷>243 mutations)，而CheckMate-227[22]將腫瘤高突變負(fù)荷定義為腫瘤突變負(fù)荷≥10 mutations/Mb；(3)基因突變可能會(huì)干擾免疫治療的效果；(4)重復(fù)腫瘤組織活檢的局限性及危險(xiǎn)性。近年來，關(guān)于測(cè)量血漿中的腫瘤突變負(fù)荷(bTMB)的phase Ⅱ POPLAR和phase Ⅲ OAK研究，顯示基于血液的TMB檢測(cè)可以預(yù)測(cè)Atezolizumab治療非小細(xì)胞肺癌的無進(jìn)展生存期[24],但是目前這一技術(shù)尚不成熟。最近，趙呈龍等[25]發(fā)現(xiàn)PD-L1≥50%且高腫瘤突變負(fù)荷組患者免疫治療療效最佳，雖然研究例數(shù)較少，不足以代表大數(shù)據(jù)，不過這可以提出是否將二者聯(lián)合作為預(yù)測(cè)標(biāo)志物的可能，更準(zhǔn)確的篩選出獲益人群。非小細(xì)胞肺癌特別是肺腺癌存在多種驅(qū)動(dòng)基因的突變，而針對(duì)這類驅(qū)動(dòng)基因突變的靶向治療有明確療效，目前的免疫治療尚不能證明優(yōu)于這類靶向治療，因此是否可以將腫瘤突變負(fù)荷表達(dá)高低作為免疫治療療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，仍需更多大樣本研究。

五、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)是基因組不穩(wěn)定中的一種，主要特點(diǎn)是短的重復(fù)的DNA序列發(fā)生缺失或擴(kuò)增等改變，常常導(dǎo)致基因發(fā)生移碼突變。Hause等[26]發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中存在微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性，且與患者預(yù)后相關(guān)。CheckMate 142[27]研究發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性結(jié)腸癌患者對(duì)PD-L1抑制劑具有較好的療效。最近的分析發(fā)現(xiàn)多種腫瘤都可表現(xiàn)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定，這提示是否可以將為衛(wèi)星不穩(wěn)定認(rèn)為是廣泛的腫瘤表型。不過也有研究表明微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定在結(jié)直腸癌及胃腺癌中占比較高，而在肺癌中發(fā)生率較低[26]。此外，與其他免疫治療生物標(biāo)志物存在相同的問題，包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測(cè)方法、劃分閾值以及伴有其他基因突變是否會(huì)影響免疫治療療效，均存在爭(zhēng)議。因此是否可將微衛(wèi)星不穩(wěn)定性作為晚期非小細(xì)胞肺癌患者免疫治療療效的預(yù)測(cè)標(biāo)志物仍有待研究。

六、腸道微生物群

腸道微生物在腫瘤發(fā)生及治療中的作用近年來逐漸被認(rèn)識(shí)。Obata等[28]發(fā)現(xiàn)腸道微生物可以通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化成熟來影響腸道黏膜的免疫系統(tǒng)從而保持腸道免疫耐受。腸道微生物可以通過影響腸黏膜免疫進(jìn)而調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)。而Routy等[29]發(fā)現(xiàn)將對(duì)免疫治療反應(yīng)率高的腸道微生物移植到無菌或經(jīng)抗生素治療后的小鼠體內(nèi)能夠改善其療效，而臨床數(shù)據(jù)提示接受抗生素治療的患者無進(jìn)展生存期及總生存率均較低，這可能是因?yàn)榭股氐氖褂脭_亂了腸道菌群、抑制了晚期非小細(xì)胞肺癌患者的免疫檢查點(diǎn)治療，其中具體機(jī)制目前尚不明確。國內(nèi)一項(xiàng)小樣本研究[30]分析了37例患者腸道微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)微生物多樣性與PD-1單抗的療效相關(guān)。但目前仍缺乏大樣本、前瞻性研究證實(shí)這一結(jié)論。

七、其他

還有研究探索了其它一些與免疫治療療效相關(guān)的分子標(biāo)記物，如體重指數(shù)(Body mass index，BMI)、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值、基因表達(dá)標(biāo)簽(Gene expression profiles，GEPs)、POLE基因突變等，而EGFR等驅(qū)動(dòng)基因突變陽性晚期非小細(xì)胞肺癌患者接受ICIs治療療效偏低[31]。但這些指標(biāo)尚未得到大樣本臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合放化療療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物

上述各個(gè)指標(biāo)基本來自于ICIs單藥治療的臨床數(shù)據(jù)，但目前更為急迫的是尋找能夠指導(dǎo)PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合放化療合理應(yīng)用的標(biāo)志物。

放化療對(duì)腫瘤微環(huán)境具有調(diào)節(jié)作用。一方面，放療可以通過直接或間接破壞腫瘤細(xì)胞DNA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡，同時(shí)放療可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1表達(dá)水平并上調(diào)抗原遞呈細(xì)胞MHC-I類分子和CD86的表達(dá),同時(shí)小劑量的射線可以清除抑制性T淋巴細(xì)胞[32]。 另一方面，化療對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有免疫調(diào)變作用并改善腫瘤微環(huán)境?；熕幬锟烧T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性的凋亡，通過“損傷相關(guān)分子模式”(damage-associated molecular patterns，DAMPs)啟動(dòng)免疫應(yīng)答[33],同時(shí)化療預(yù)處理可以清除免疫抑制性細(xì)胞并下調(diào)免疫抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)形成促進(jìn)免疫效應(yīng)的微環(huán)境[34]。因此，盡管尚無直接的研究探索PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合放化療的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，我們認(rèn)為可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤免疫微環(huán)境的指標(biāo)，如監(jiān)測(cè)腫瘤PD-L1表達(dá)、腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞、腫瘤突變負(fù)荷等指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化,用以指導(dǎo)PD-1/PD-L1抑制劑和放化療的聯(lián)合應(yīng)用。但動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤免疫微環(huán)境，需要對(duì)腫瘤進(jìn)行再次活檢，可喜的是，有臨床研究報(bào)道這種再活檢是相對(duì)安全的[35]。

結(jié) 論

ICIs已成為晚期非小細(xì)胞肺癌治療的重要方法之一，但在臨床應(yīng)用中仍受到一定限制，療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物的研發(fā)可以避免盲目的應(yīng)用并提高治療療效。目前ICIs與常規(guī)放、化療的聯(lián)合應(yīng)用顯示出更廣泛的應(yīng)用前景，但目前尚缺乏深層次的理論基礎(chǔ)來指導(dǎo)這種聯(lián)合治療模式的合理應(yīng)用。本文初步總結(jié)了免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合常規(guī)放、化療療效可能的預(yù)測(cè)指標(biāo)，以期為進(jìn)一步的研究提供方向。