肺腺癌患者差異甲基化區(qū)域分析

李曉晗 曹國(guó)磊 牛海文 何麗麗 王清鶴 曹嘉芮 袁夢(mèng) 阿麗亞·奧斯曼 李蕊 羅琴

肺癌是目前全世界死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中肺腺癌約占肺癌50%，五年存活率低至20%[2]。DNA甲基化為DNA化學(xué)修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下改變遺傳表現(xiàn)[3]。研究表明甲基化在正常人群中一直趨于穩(wěn)定，但是在腫瘤細(xì)胞中卻呈現(xiàn)出異常表達(dá)的征象[4]。差異甲基化區(qū)域(DMR)是指基因組上不同組間甲基化值有顯著差異的一個(gè)片段。目前關(guān)于肺腺癌患者差異甲基化區(qū)域分析的研究鮮有報(bào)道。本研究擬通過(guò)850K芯片甲基化檢測(cè)平臺(tái)于全基因組水平檢測(cè)肺腺癌組與正常對(duì)照組甲基化區(qū)域，利用Bump hunter的方法尋找兩組差異甲基化區(qū)域，并利用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)和KOBAS軟件對(duì)差異甲基化區(qū)域所對(duì)應(yīng)目的基因行進(jìn)一步GO分析和KEEG分析，旨在探討差異甲基化區(qū)域在肺腺癌發(fā)病中的作用機(jī)制，為肺腺癌的診治提供新的理論依據(jù)。

資料與方法

一、 一般資料

納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：收取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2019年1月至2019年12月肺腺癌患者與正常對(duì)照人群外周血標(biāo)本各4例，并對(duì)其進(jìn)行DNA提取。肺腺癌患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷為肺腺癌，不患有其他病理學(xué)類型腫瘤，無(wú)慢性阻塞性疾病，無(wú)其他心血管疾病，無(wú)栓塞的患者。對(duì)照組選取標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)期就診我院的無(wú)惡性腫瘤疾病，無(wú)慢性阻塞性肺疾病，無(wú)心血管疾病，無(wú)栓塞等的正常人群作為對(duì)照組。所有入組人員均簽署相關(guān)知情同意書(shū)，并經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)為：2019BC007)。

二、Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip 芯片(850K芯片)甲基化檢測(cè)平臺(tái)對(duì)各樣本差異甲基化區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1 提取DNA以及樣品質(zhì)檢 使用試劑盒(TIANGEN BIOTECH,BEIJING)提取外周血中的基因組DNA。對(duì)于DNA，先用分光光度計(jì)定量，并將樣品調(diào)到標(biāo)準(zhǔn)濃度50 ng/μL，20 μL，然后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。樣品電泳主帶清晰，通常不小于10 kb，沒(méi)有明顯降解，總量5 μg以上，可進(jìn)行下游的甲基化芯片實(shí)驗(yàn)。

2 亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化 根據(jù)ILLumina官方推薦的Zymo EZ DNA Methylation Kit優(yōu)化方法進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。

3 DNA擴(kuò)增 制備MSA3板 在樣本中加入0.1N NaOH使DNA變性為單鏈，經(jīng)中和后加入全基因組擴(kuò)增試劑，在37℃恒溫條件下過(guò)夜孵育。

4 DNA的片段化、重懸 DNA片段化 擴(kuò)增后產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)酶解處理，得到片段化DNA。DNA沉淀：加入異丙醇在4℃下離心沉淀DNA片段。DNA重懸：沉淀后的DNA在空氣中干燥后，加入雜交緩沖試劑使DNA沉淀重新溶解。

5 DNA與芯片的雜交 將重懸后的DNA樣本與準(zhǔn)備好的芯片雜交，置于雜交爐內(nèi)過(guò)夜。在雜交過(guò)程中，片段化的DNA經(jīng)過(guò)變性，與特異位點(diǎn)的50個(gè)堿基退火。

6 芯片清洗、單堿基延伸、染色 洗去未雜交和非特異雜交的DNA，以捕獲到的DNA為模板，在芯片上加入可檢測(cè)的熒光基團(tuán)，從而區(qū)分樣本的甲基化狀況。包被芯片：將反應(yīng)完成的芯片放入XC4試劑中，使其表面包裹上一層粘性透明液體，再將其放入真空環(huán)境下干燥1小時(shí)，從而將芯片包被，保護(hù)其信號(hào)穩(wěn)定較長(zhǎng)的時(shí)間。

7 芯片掃描和數(shù)據(jù)提取 提前下載相應(yīng)的manifest文件，將處理好的芯片放入掃描儀，利用激光激發(fā)芯片上單堿基延伸產(chǎn)物的熒光基團(tuán)，掃描儀獲取由熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光，并生成原始數(shù)據(jù)，記錄掃描結(jié)果存放的位置。由此所得的數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入R包ChAMP軟件進(jìn)行分析，從而就得到每個(gè)樣本每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平數(shù)據(jù)。

三、數(shù)據(jù)分析

1 將掃描得到的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)R包ChAMP，獲得每個(gè)位點(diǎn)的原始信號(hào)值和DetectionP等信息，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，再對(duì)探針類型偏倚校正后得到最終可用于差異分析的甲基化水平(Beta值)。

2 差異甲基化區(qū)域分析 采用Bumphunter的方法尋找差異甲基化區(qū)域，該方法首先根據(jù)位點(diǎn)距離信息來(lái)聚簇cluster，然后再在每個(gè)cluster中篩選出甲基化水平一致的連續(xù)候選區(qū)段，Bumphunter根據(jù)候選區(qū)段構(gòu)建線性統(tǒng)計(jì)模型，篩選出明顯差異的區(qū)段(P<0.05)。

3 功能富集分析 將篩選出來(lái)的差異甲基化區(qū)域進(jìn)行GO功能和KEGG途徑分析，了解該區(qū)域的功能和可能參與的通路。

結(jié) 果

一、差異甲基化區(qū)域?qū)Ρ确治?/h3>

肺腺癌患者與正常對(duì)照組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)七個(gè)差異基因甲基化區(qū)域，分別為DMR-1，DMR-2，DMR-3，DMR-4，DMR-5，DMR-6，DMR-7；其中DMR-1、DMR-2、DMR-3 、DMR-4、DMR-6位于6號(hào)染色體上，DMR-5位于11號(hào)染色體上，DMR-7位于20號(hào)染色體上(P<0.05)(表1)。DMR-1(33048254-33048879)寬度為625bp；DMR-2(31148332-31148666)寬度334bp；DMR-3(28557047-28557765)寬度718bp；DMR-4(29648452-29649084)寬度632bp；DMR-5(18433500-18434354)寬度854bp；DMR-6(31539539-31540121)寬度582bp； DMR-7(3051954-3052345)寬度391bp。(P<0.05)。 肺腺癌組DMR-1，DMR-2，DMR-4，DMR-5，DMR-7其CPG位點(diǎn)甲基化水平均高于正常對(duì)照組，其目的基因分別是HLA-DPB1、HLA-DPA1，POU5F1，2FP57，LDHC，OXT，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。而肺腺癌組DMR-3，DMR-6其CPG位點(diǎn)甲基化水平位點(diǎn)低于正常對(duì)照組，其目的基因分別是RP5-1186N24.3、SCAND3，LTA，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 肺癌組與正常對(duì)照組差異甲基化區(qū)域?qū)Ρ?/p>

表2 肺癌組與正常對(duì)照組差異甲基化區(qū)域所含甲基化位點(diǎn)及目的基因

二、目的基因的基因本體論和KEGG途徑分析

1 GO功能富集分析 GO富集分析(Gene Ontology，GO)主要包括三個(gè)部分，即生物學(xué)途徑(Biological process)，細(xì)胞成分(cellular component)和分子功能(Molecular Function)。本課題組以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)這三個(gè)部分分別篩選出差異甲基化可能參與的30個(gè)GO功能，結(jié)果顯示肺腺癌差異甲基化基因在多種不同的功能領(lǐng)域中表達(dá)，功能富集最顯著的有生物學(xué)途徑中的正向調(diào)節(jié)干擾素-γ|GO：0032729，乳酸氧化|GO：0019516，丙酮酸的乳酸生物合成過(guò)程|GO：0019244，后腸收縮的積極調(diào)節(jié)|GO：0060450，慢性炎癥反應(yīng)對(duì)抗原刺激的正向調(diào)節(jié)|GO：0002876等途徑；細(xì)胞成分中的MHCⅡ類蛋白復(fù)合物|GO：0042613，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的積分成分|GO：0071556，膜的管腔側(cè)|GO：0098576，clathrin-包膜內(nèi)細(xì)胞囊泡膜|GO：0030669，ER至高爾基轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡膜|GO：0012507等成分；分子功能中的催產(chǎn)素受體結(jié)合|GO：0031855，神經(jīng)垂體激素活性|GO：0005185，升-乳酸脫氫酶活性|GO：0004459，肽抗原結(jié)合|GO：0042605，腫瘤壞死因子受體結(jié)合|GO：0005164等功能；其中在生物學(xué)途徑方面，主要在正向調(diào)節(jié)干擾素-γ|GO：0032729中；在細(xì)胞成分方面，主要在MHCⅡ類蛋白復(fù)合物|GO：0042613中；在分子功能中，主要與催產(chǎn)素受體|GO：0031855等有著一定的關(guān)系。

2 KEGG信號(hào)通路分析 根據(jù)篩選出來(lái)的肺腺癌差異甲基化區(qū)域進(jìn)行KEGG分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出統(tǒng)計(jì)學(xué)上最顯著的30條通路，然后發(fā)現(xiàn)肺腺癌差異甲基化區(qū)域參與多種疾病中，其中在l型糖尿病|hsa04940、NF-κB信號(hào)通路|hsa04064等中與腫瘤的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系(圖1)。

圖1 差異甲基化區(qū)域在KEGG中的通路圖注：上述為差異甲基化區(qū)域在KEGG Pathway中所表達(dá)的最顯著的通路，縱坐標(biāo)為通路名稱，坐標(biāo)為-log10(P值)。

討 論

大量研究表明，在表觀遺傳學(xué)上研究最深入的就是DNA甲基化[4]，差異甲基化區(qū)域是指基因組上不同組間甲基化值明顯不同的一個(gè)片段。DNA的異常甲基化與癌癥等相關(guān)疾病有著緊密的聯(lián)系，它能同時(shí)調(diào)控原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，如果原癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA低甲基化，那么它可以激活原癌基因的表達(dá)，而如果抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化則使其轉(zhuǎn)錄受到抑制作用[5]，這樣就對(duì)腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展、治療以及預(yù)后起著至關(guān)重要的作用[3]。表觀遺傳學(xué)改變可能不適當(dāng)?shù)丶せ罨蛞种屏烁鞣N信號(hào)通路，從而導(dǎo)致癌癥[6]。例如Yang Zhaoyang等學(xué)者研究表明PAK1等基因的甲基化在LUAD的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，主要通過(guò)將多種細(xì)胞外信號(hào)對(duì)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)行一定的影響[7]。

本研究利用高通量甲基化檢驗(yàn)平臺(tái)對(duì)肺腺癌組患者及正常組人群全基因組水平檢測(cè)其目的基因甲基化水平，并對(duì)其差異甲基化區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步的研究，共篩選出了七組差異甲基化區(qū)域DMR-1、DMR-2、DMR-3、DMR-4、DMR-5、DMR-6、DMR-7。本研究發(fā)現(xiàn)的七組差異甲基化的區(qū)域DMR-1的目的基因是HLA-DPB1、HLA-DPA1，DMR-2的目的基因是POU5F1，DMR-3的目的基因是RP5-1186N24.3、SCAND3，DMR-4的目的基因是2FP57，DMR-5的目的基因是LDHC，DMR-6的目的基因是LTA，DMR-7的目的基因是OXT?，F(xiàn)已有研究表明HLA-DPB1與EGFR陽(yáng)性肺腺癌顯著相關(guān)[8]，HLA-DPB1、HLA-DPA1高甲基化與糖尿病有關(guān)[9]，這與我們課題組在KEGG中的研究相符合，所以我們猜測(cè)HLA-DP基因的高甲基化可能導(dǎo)致糖尿病的產(chǎn)生，進(jìn)而增加了腫瘤的發(fā)病率。既往研究表明HLA-DPA1在肝癌中呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)[10]，SCAND3基因在肝癌中甲基化異常增高，這與我們課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，但這兩個(gè)基因都在肺腺癌中有高表達(dá)現(xiàn)象，所以還有待我們課題組進(jìn)一步研究驗(yàn)證，或者其甲基化的狀態(tài)對(duì)腫瘤的產(chǎn)生也有雙面效應(yīng)。已有研究表明POU5F1其啟動(dòng)子高甲基化，可使其在體細(xì)胞中表達(dá)沉默[11]，POU5F1與腫瘤微血管密度呈正相關(guān)，腫瘤微血管密度與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，POU5F1在肺腺癌中高表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)可預(yù)測(cè)肺癌的發(fā)生[12]?，F(xiàn)已有研究表明LDHC是癌癥患者典型的炎癥標(biāo)記物[13]，Koslowski等人進(jìn)行的一項(xiàng)研究中，也表明NSCLC細(xì)胞系可由LDHC高甲基化所介導(dǎo)。曾有研究表明LTA低甲基化在某些炎癥中表達(dá)，眾所周知，炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而且DNA低甲基化被認(rèn)為通過(guò)誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性和原癌基因的活化而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[3]。關(guān)于OXT基因目前僅發(fā)現(xiàn)該基因的高甲基化在精神性疾病中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，2FP57目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，但在本研究中卻發(fā)現(xiàn)2FP57、OXT基因的不同甲基化狀態(tài)與肺腺癌相關(guān)，為廣大學(xué)者提供了新的探討方向。

在本研究中，我們?yōu)榱诉M(jìn)一步研究目的基因甲基化的作用機(jī)制，為此對(duì)其進(jìn)行了GO分析和KEGG分析。分析表明，這些基因在IFN-γ、MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合體、催產(chǎn)素及NF-κB信號(hào)通路中呈現(xiàn)高度富集狀態(tài)。有研究表明MHCⅡ類在NSCLC中的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，并通過(guò)免疫系統(tǒng)在腫瘤的進(jìn)化、抗腫瘤以及促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要作用，IFN-γ可以誘導(dǎo)不同的癌細(xì)胞系表達(dá)MHC-Ⅱ類[14]，也在炎癥、抗感染、腫瘤免疫檢測(cè)以及抗腫瘤中發(fā)揮重要作用，并限制其清除腫瘤細(xì)胞的能力[15]，這些與我們的研究一致。眾所周知，神經(jīng)內(nèi)分泌激素包括催產(chǎn)素，曾有報(bào)道與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤有關(guān)，如小細(xì)胞肺癌，同時(shí)還調(diào)節(jié)著人類的情緒、社會(huì)認(rèn)知、社會(huì)行為和壓力相關(guān)疾病[16]；但關(guān)于肺腺癌尚未見(jiàn)報(bào)道，課題組擬進(jìn)一步研究。目的基因的各種甲基化狀態(tài)還主要參與了NF-κB信號(hào)通路，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)與炎癥、增殖、致癌和凋亡相關(guān)的基因有關(guān)[17]，我們知道癌癥的產(chǎn)生、發(fā)展等都取決于細(xì)胞的生存狀況與死亡信號(hào)之間的平衡，以上的研究都表明NF-κB參與了癌變過(guò)程中的多個(gè)步驟，也已經(jīng)有相關(guān)動(dòng)物模型和細(xì)胞培養(yǎng)的研究表明NF-κB與肺癌發(fā)生之間的聯(lián)系，這也證實(shí)了本課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。關(guān)于通路中富集首位的Ⅰ型糖尿病，有研究表明糖尿病患者的癌癥發(fā)生率比無(wú)糖尿病的人高20～25倍[18]。關(guān)于HAS和HTLV-1的感染，目前研究只局限于炎癥、某些腫瘤有關(guān)，與肺腺癌的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道，所以我們考慮由于HAS和HTLV-1都屬于病毒感染，而有研究表明長(zhǎng)期的炎癥感染可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要條件，那這兩種病毒的感染與肺腺癌的關(guān)系值得我們進(jìn)一步探討。

綜上所述，肺腺癌患者DNA甲基化的狀態(tài)可能是引起肺腺癌發(fā)生的關(guān)鍵因素，第一，HLA-DP，POU5F，以及LDHC的甲基化狀態(tài)在肺腺癌的發(fā)生中起著重要的作用；第二，在GO功能和KEGG通路中，也表明DNA甲基化異常參與了疾病發(fā)展的作用機(jī)制。總之，這些差異甲基化區(qū)域、基因以及信號(hào)可能參與了肺腺癌的發(fā)生，本課題組擬進(jìn)行擴(kuò)大樣本含量，同時(shí)獲取肺腺癌及癌旁的組織學(xué)標(biāo)本，進(jìn)一步對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，為肺腺癌的診治提供新的、深入的理論依據(jù)。