一株高效羽毛降解菌株Bacillus aryabhattaiS-2的分離鑒定及酶活力特性研究

倪維敏，胡又文，陶靈琳，費(fèi)雪婷，陳美菊，肖秋菊，何欣怡，陶 向，邵歡歡，雍 彬

（四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610100）

近年來(lái)，我國(guó)的家禽業(yè)發(fā)展迅速，每年產(chǎn)生的廢棄羽毛高達(dá)上百萬(wàn)噸［1］.大量羽毛廢棄物不僅造成了資源的巨大浪費(fèi)，還污染環(huán)境.傳統(tǒng)的填埋、焚燒處理不僅生產(chǎn)成本高，還容易造成家禽業(yè)各種疾病的相互傳染［2-4］.

羽毛是一種蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%以上的重要蛋白質(zhì)資源［5］，其中角蛋白是廣泛存在于羽毛中的一種硬性蛋白，因其含有緊密交聯(lián)的氫鍵、二硫鍵和疏水作用力，因此，在自然條件下降解速度較慢［6-7］.目前常采用的處理羽毛廢棄物的物理、化學(xué)方法，如高溫蒸煮、強(qiáng)壓處理和酸堿水解等傳統(tǒng)的技術(shù)手段，不僅存在著能耗高、降解效率低的問(wèn)題，還會(huì)破壞角蛋白中一些必需氨基酸，造成不必要的資源浪費(fèi)［3，8-9］.生物降解羽毛廢棄物的方法更為綠色環(huán)保，反應(yīng)過(guò)程溫和，且效果顯著；在保證羽毛飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不受損耗，節(jié)約生產(chǎn)能源的同時(shí)，還可得到更為優(yōu)質(zhì)的飼料產(chǎn)品［10］，對(duì)徹底降解角蛋白和對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行有效的資源化利用具有極大的現(xiàn)實(shí)意義［11］.

自然界廣泛存在能夠降解角蛋白的微生物，如短小芽孢桿菌［12］、枯草芽孢桿菌［13］和蘇云金芽孢桿菌［14］等，多個(gè)研究表明，它們單獨(dú)或協(xié)同進(jìn)行固體發(fā)酵，均能使羽毛降解率達(dá)到80%以上［15］.但是這些菌株也存在缺點(diǎn)（如羽毛降解速度慢、培養(yǎng)條件復(fù)雜等問(wèn)題），通常難以進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用.因此，進(jìn)一步改造或篩選能夠高效降解羽毛的菌株具有重要的研究?jī)r(jià)值.本研究從成都市的家禽養(yǎng)殖場(chǎng)羽毛堆積處的土壤中篩選分離出了一株具有羽毛降解能力的菌株，通過(guò)測(cè)序、生理生化檢測(cè)以及酶活力測(cè)定等實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了鑒定，旨在為羽毛的規(guī)?；到馓幚?，及飼料中添加低成本蛋白質(zhì)和氨基酸等提供新的思路［16］.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集 從成都市的家禽市場(chǎng)附近收集已經(jīng)出現(xiàn)腐爛的雞毛及其周圍土壤，加入10 mL無(wú)菌超純水震蕩，沉淀后取上清液用于后期菌株分離實(shí)驗(yàn).

1.1.2 培養(yǎng)基LB 液體培養(yǎng)基（g／L）：0.1 g／mL NaCl、0.05 g／mL酵母浸提膏、0.1 g／mL蛋白胨，調(diào)pH介于7.0～7.5 之間.牛奶平板：質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%脫脂奶粉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂.發(fā)酵培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.15% K2HPO4、0.002 5% MgSO4·7H2O、0.001 5%FeSO4·7H2O、0.000 5%ZnSO4·7H2O、0.002 5%CaCl2、羽毛碎片10 mL／0.1 g，pH ＝7.4.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株分離、篩選及觀察 取1 g 土樣，加10 mL超純水振蕩混合后靜置沉淀，取上清液1 mL，涂布在以羽毛為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基平板上，37 ℃下培養(yǎng)48 h，挑取3 個(gè)直徑較大的菌落劃線接種于LB培養(yǎng)基的平板中，在37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)24 h，得到單菌落，分別再次接種于僅含有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，選出生長(zhǎng)效果最好的一個(gè)菌株，然后將該菌株保存?zhèn)溆?

將篩選出的菌株分離純化后，劃線于固體LB培養(yǎng)基平板中，放在37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，20 h 后，直接用肉眼觀察菌落的顏色、形態(tài)、大小、表面質(zhì)地和邊緣形態(tài)等外部形態(tài)特征.取單菌落涂片，革蘭氏染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形狀及大小.

1.2.2生化特征檢測(cè) 根據(jù)杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管的使用說(shuō)明，分別測(cè)定菌株對(duì)賴氨酸、鳥氨酸、枸櫞酸鹽、尿素、硫化氫、磷酶、ONPG、棉子糖、戊糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、二磷酶、靛基質(zhì)、V-P 和苯丙氨酸等的作用，參照《發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌生化編碼鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定.

1.2.3菌株DNA的提取及鑒定 將菌株接種于50 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃培養(yǎng)一夜，按照Omega Bio-Tek 公司生產(chǎn)的試劑盒Bacterial DNA Kit提取DNA.采用的引物為：

27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’／1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGAG-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 500 bp.引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成.

序列的測(cè)定由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成，測(cè)序完畢后，將該DNA序列復(fù)制至Blast中進(jìn)行序列比對(duì)，以確定菌株的類別.利用MEGA 6.0軟件鄰接法［17］構(gòu)建該菌的進(jìn)化樹，同時(shí)將該菌的序列用Ex-Taxon進(jìn)行在線菌株鑒定.

1.2.4堿性蛋白酶酶活力測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)使用改進(jìn)的Folin 酚試劑顯色法來(lái)檢測(cè)酶活力：1 mL發(fā)酵液7 000 r／min，4 ℃離心1 min，取0.2 mL上清液與0.2 mL 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)2%水解酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，50 ℃加熱10 min，加入0.4 mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液室溫放置20 min，4 ℃12 000 r／min離心5 min，取0.25 mL上清液加到1.25 mL的0.4 mol／L Na2CO4中，50℃加熱2 min，0.25 mL福林酚試劑繼續(xù)加熱20 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)其680 nm的OD值.

其中k為吸光常數(shù)，取值100.

1.2.5羽毛降解率測(cè)定 記錄初始羽毛的質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別記為m1初和m2初，培養(yǎng)后用細(xì)胞過(guò)濾器濾下殘?jiān)?，用烘箱烘至恒質(zhì)量，記為m1殘和m2殘，兩者的質(zhì)量之差就是降解部分的質(zhì)量.

1.2.6牛奶平板水解圈實(shí)驗(yàn) 在牛奶平板中均勻地點(diǎn)3 個(gè)樣，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，毎隔24 h觀察一次降解情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑以及水解圈直徑，水解圈直徑／菌落直徑的比值越大，說(shuō)明降解效果越好.

1.2.7生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將OD600為1.0 的菌液接種0.2～50 mL的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r／min的搖床中培養(yǎng)76 h，每隔4 h 取樣，測(cè)波長(zhǎng)為600 nm處的OD值，根據(jù)OD600值的變化趨勢(shì)推測(cè)菌株的生長(zhǎng)狀況.

1.2.8發(fā)酵條件對(duì)酶活力的影響 1）不同的接種量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響.將OD600為1.0 的菌液以體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%、10%的接種量分別接種于含有0.5 g 羽毛／瓶，且初始pH 為7.0 的50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r／min 培養(yǎng)48 h，進(jìn)行酶活力測(cè)定.

2）不同的蛋白底物對(duì)產(chǎn)酶活力的影響.取1 mL菌液分別接種于以0.5 g 雞毛、頭發(fā)、脫脂牛奶和酪蛋白作為蛋白質(zhì)底物配制的培養(yǎng)基中，37℃、180 r／min培養(yǎng)48 h，進(jìn)行酶活力測(cè)定.

3）不同的羽毛含量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響.分別稱取0.05、0.25、0.5、0.75 和1 g 的雞毛用于配制50 mL的LB培養(yǎng)基，接種1 mL 菌液于初始pH 為7.0 的50 mL的培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r／min培養(yǎng)48 h，進(jìn)行酶活力測(cè)定.

4）不同的初始pH 對(duì)產(chǎn)酶活力的影響.分別調(diào)節(jié)配制好的50 mL 培養(yǎng)基的初始pH 為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，接種1 mL 的菌液于37 ℃、180 r／min培養(yǎng)48 h，進(jìn)行酶活力測(cè)定.

5）不同的培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶活力的影響.接種1 mL菌液到初始pH為7.0，羽毛含量0.5 g／瓶的50 mL培養(yǎng)基中，分別將各個(gè)培養(yǎng)基放置在培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、37 和40 ℃的180 r／min的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行酶活力測(cè)定.

6）不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力的影響.接種1 mL到初始pH為7.0，羽毛0.5 g／瓶，于37 ℃、180 r／min 的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72、96 和120 h后，進(jìn)行酶活力測(cè)定.

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)該菌株經(jīng)革蘭氏染色后呈現(xiàn)紫紅色，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌.其菌落形態(tài)為圓形，顏色淡黃色，表面略微向上凸起，表面濕潤(rùn)，邊緣略有缺刻，顏色一致，菌落形態(tài)如圖1 所示.

圖1 菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology

2.2 生化特性根據(jù)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管使用說(shuō)明書對(duì)S-2 菌株的生化特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S-2 菌株能水解賴氨酸、鳥氨酸、尿素和Opng，且V-P反應(yīng)如表1 所示呈陽(yáng)性，牛奶平板水解實(shí)驗(yàn)也表明其可以有效水解牛奶，菌落形態(tài)如圖2 所示.

圖2 牛奶平板降解圈Fig.2 Degradation rings on the milk plate

表1 分離菌株S-2 的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of isolated strain S-2

2.3 菌株DNA 序列測(cè)定及進(jìn)化樹的構(gòu)建將測(cè)序得到S-2 菌株的16S序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并利用MEGA 6.0 軟件鄰接法構(gòu)建該菌的進(jìn)化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)該菌株與Bacillus aryabhattai QK2 的同源度最高，且親緣關(guān)系最近.同時(shí)，通過(guò)EzTaxon（www.ezbiocloud.net）進(jìn)行菌種鑒定，也發(fā)現(xiàn)該菌株與Bacillus aryabhattai 菌株的相似度最高，兩者相似度高達(dá)99.72%.結(jié)合該菌株的生化特性和16S序列比對(duì)結(jié)果，判定該菌株為Bacillus aryabhattai菌株，因此，命名為Bacillus aryabhattai S-2.

圖3 B.aryabhattai S-2 的16S RNA進(jìn)化樹分析Fig.3 The analysis of 16S RNA evolutionary tree of B.aryabhattai S-2

2.4 生長(zhǎng)曲線及酶活力測(cè)定每隔4 h 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行菌液OD600值測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B.aryabhattai S-2經(jīng)過(guò)4 h后開始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，并在52 h時(shí)達(dá)到最大值.同時(shí)，對(duì)其胞外堿性蛋白酶活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在生長(zhǎng)初期，胞外堿性蛋白酶活力隨菌體數(shù)的增加而增加，并在48 h 時(shí)達(dá)到最高值20.1 U／mL，但是在48 h后酶活力快速下降（圖4）.

圖4 生長(zhǎng)曲線及酶活力值Fig.4 The growth curve and enzyme activity values

2.5 羽毛降解率測(cè)定使用B.aryabhattai S-2 分別在發(fā)酵培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中對(duì)羽毛進(jìn)行降解處理，相比LB 培養(yǎng)基，B.aryabhattai S-2 在發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)羽毛的降解效果更好，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h降解率可高達(dá)97.2%，而在LB 培養(yǎng)基中則需培養(yǎng)312 h，羽毛降解率才能達(dá)到96.6%.這表明B.aryabhattai S-2 可以對(duì)羽毛進(jìn)行高效降解，見圖5和圖6.

圖5 B.aryabhattai S-2 對(duì)羽毛的降解作用Fig.5 Feather degradation by B.aryabhattai S-2

圖6 在發(fā)酵培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的降解率變化Fig.6 Changes of the degradation rate in the fermentation medium and LB medium

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶活力的影響

2.6.1接種量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 將不同體積的菌液接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行酶活力測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種不同量的B.aryabhattai S-2 酶，活力有較大的差別（圖7）.當(dāng)接種量為2%時(shí)，該菌株的產(chǎn)酶活力達(dá)到最大值23.93 U／mL，并且隨著接種量的增加，產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì).表明相對(duì)較低的B.aryabhattai S-2 接種量有助于增加蛋白酶活力.

圖7 接種量對(duì)酶活力的影響Fig.7 The effect of the inoculum size on the enzyme activity

2.6.2 不同初始pH 對(duì)產(chǎn)酶活力的影響由圖8可知，B.aryabhattai S-2 的產(chǎn)酶活力隨初始pH值的變化呈現(xiàn)不同數(shù)值，開始隨著初始pH 的增加而增加，在初始pH ＝7 時(shí)達(dá)到最大值23.44 U／mL；然后呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，在初始pH ＝8.5 時(shí)降低至最小值12.10 U／mL.可見，不同的pH 值對(duì)B.aryabhattai S-2菌株的酶活力有一定的影響作用，且該菌株的蛋白酶在偏堿性的環(huán)境中具有較高的酶活力.

圖8 pH對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig.8 The effect of PH on the enzyme production

2.6.3不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 將B.aryabhattai S-2 接種至培養(yǎng)基中，每隔24 h 取樣，并對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定（圖9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S-2 菌株的蛋白酶活力在生長(zhǎng)初期不斷增加，并在48 h時(shí)達(dá)到最高（20.44 U／mL），隨后酶活力開始不斷下降，在120 h 時(shí)最低為12.40 U／mL.表明該菌株的胞外蛋白酶活力最佳培養(yǎng)時(shí)間為48 h.

圖9 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig.9 The effect of the culture time on the enzyme production

2.6.4不同羽毛含量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 以不同重量的羽毛（0.250 5 g）作為底物，加入含有S-2 菌株的培養(yǎng)基（50 mL）中進(jìn)行酶活力測(cè)定.結(jié)果表明（見圖10），在較低羽毛含量培養(yǎng)基中S-2 菌株酶活力會(huì)隨羽毛含量增加而增加，并在0.5 g／50 mL 時(shí)達(dá)到最高值21.56 U／mL；隨后，酶活力隨底物濃度增加而降低.表明該菌株的產(chǎn)酶活力易受到底物濃度的影響.

圖10 羽毛含量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig.10 The effect of the feather content on the enzyme production

2.6.5不同蛋白底物對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 將B.aryabhattai S-2接種至不同蛋白底物中培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力，如圖11所示.當(dāng)?shù)鞍椎孜餅槊撝Ｄ袒蚋衫宜貢r(shí)，該菌的產(chǎn)酶活力較大，分別為44.53和41.86 U／mL；其次是羽毛做蛋白底物時(shí)，該菌的產(chǎn)酶活力為23.26 U／mL；當(dāng)?shù)鞍椎孜餅轭^發(fā)時(shí)，該菌的產(chǎn)酶活力最低，僅有21.59 U／mL.表明B.aryabhattai S-2不僅對(duì)羽毛有一定的降解能力，對(duì)脫脂牛奶和酪蛋白也均有較高的降解能力，當(dāng)培養(yǎng)基中蛋白底物不同時(shí)，B.aryabhattai S-2的產(chǎn)酶活力也存在著較大差異.

圖11 蛋白底物對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig.11 The effect of the protein substrate on the enzyme production

2.6.6不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 將B.aryabhattai S-2 接種至培養(yǎng)基中，在不同溫度條件下培養(yǎng)48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的增加，該菌的產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)出先升高、再降低的趨勢(shì)（圖12），當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，產(chǎn)酶活力最大（22.67 U／mL）.可見溫度較低時(shí)該菌株的活性會(huì)受抑制，導(dǎo)致產(chǎn)酶活力較低；而當(dāng)溫度較高時(shí)，部分菌株可能因?yàn)闇囟冗^(guò)高而失活，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酶活力有所下降.這表明，該菌株的產(chǎn)酶活力易受溫度影響.

圖12 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig.12 The effect of the culture temperature on the enzyme production

3 討論與結(jié)論

廢棄羽毛的不合理處置對(duì)環(huán)境危害極大，生物降解法高效且溫和的特性是它逐漸發(fā)展為近年來(lái)熱點(diǎn)研究方向的重要因素.早期有關(guān)角蛋白降解的研究主要來(lái)自真菌及放線菌，如真菌中的白假絲酵母（Candida albicans）和皮膚癬菌，放線菌中的鏈霉菌（Streptomyces）和高溫單胞菌屬（Thermomona）都是降解角蛋白的優(yōu)勢(shì)菌群［18-19］.但是，這部分菌群往往具有致病性或培養(yǎng)條件苛刻，能用于解決廢棄羽毛問(wèn)題的真菌或放線菌并不多［20］.

目前，細(xì)菌是被研究最多的羽毛降解菌，主要以芽孢桿菌為主.熊乙等［21］將來(lái)自地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis BBE11-1）的角蛋白酶N 端進(jìn)行替換改造，實(shí)現(xiàn)了熱穩(wěn)定性的提高，但是卻降低了該酶70%的酶活力.

本研究從土壤中分離得到一株能夠高效降解羽毛的菌株，經(jīng)鑒定為B.aryabhatta S-2.阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）是土壤中常見的一種芽孢桿菌，對(duì)大分子化合物的降解作用較強(qiáng)，而且還可以促進(jìn)植物對(duì)金屬離子、干旱與病害等逆境的耐受性，因此，在工業(yè)、食品和農(nóng)業(yè)等方面應(yīng)用較為廣泛［22］.酶活力測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B.aryabhatta S-2 能在20～40 ℃的溫度范圍內(nèi)發(fā)揮作用，并在35～40 ℃內(nèi)均具有較高的酶活力.

周童娜等［20］分離篩選到的Arthrobacter aurescens N01，也是一種新型羽毛降解菌，經(jīng)72 h 發(fā)酵后，對(duì)羽毛角蛋白的降解率為75%.本研究篩選得到的菌S-2 在培養(yǎng)72 h 后降解率高達(dá)88.2%，且酶活力也高于A.aurescens N01.部分降解羽毛菌株的發(fā)酵條件較為苛刻，楊連［16］篩選得到的B.amyloliquefaciens K11，最適溫度高達(dá)50 ℃，且最適pH 為11，偏堿性.B.aryabhattai S-2 的培養(yǎng)條件則較為溫和，在溫度37 ℃，pH ＝7.0 時(shí)即可達(dá)到最大酶活力，且對(duì)羽毛的降解率較高.因此，B.aryabhattai S-2 可以在羽毛降解的應(yīng)用中發(fā)揮重要的作用.

綜上所述，本研究分離得到了一株能夠高效降解羽毛的阿氏芽孢桿菌B.aryabhattai S-2，并對(duì)降解能力及最適溫度和pH 值等多個(gè)方面進(jìn)行了初步探究.迄今為止，國(guó)內(nèi)外還未見該菌用于降解羽毛角蛋白的相關(guān)報(bào)道，為未來(lái)深入研究降解機(jī)制及其工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).